海洋创伤弧菌反式翻译系统关键因子SmpB基因的克隆及原核表达

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种重要的"人鱼共患病"病原菌。通过克隆创伤弧菌反式翻译系统核心因子小蛋白B(Small molecular protein B,SmpB)基因,构建携带目的基因的原核表达质粒,为后续研究SmpB蛋白的互作网络、SmpB蛋白与创伤弧菌致病性之间的关系并以此开发新型的抑菌靶标奠定基础。使用LiCl沉淀法提取创伤弧菌基因组DNA,以它为模板,PCR扩增目的基因,并构建到pET-28a原核表达载体上测序鉴定后对SmpB序列进行生物信息学分析,将正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。结果表明使用LiCl沉淀法成功提取到高质量创伤弧菌基因组DNA,以其为模板,扩增到smpB基因,并成功构建pET-28a原核表达重组质粒,测序鉴定正确;smpB基因全长为486 bp,编码161个氨基酸,分子量为18.41 kD,理论等电点为10.28,不稳定系数为35.02,总平均亲水性为-0.635,SmpB蛋白整体表现为稳定亲水性蛋白。生物信息学分析显示其高级结构核心部分为5个β折叠组成的桶状结构,外围由3个α螺旋组成,SmpB C-端亦为α螺旋。诱导表达的重组融合蛋白相对分子质量大小在25.0 kD附近,显示在E.coli中成功表达了SmpB蛋白。

人程序性死亡受体配体1免疫球蛋白可变区结构域基因酵母双杂交诱饵质粒的构建及其自激活检测

目的 构建人程序性死亡受体配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)免疫球蛋白可变区(immunoglobulin variable region,IgV)结构域基因酵母双杂交重组诱饵质粒,检测其在酵母中的表达情况,检测PD-L1 IgV蛋白细胞毒性和自我激活,以及PD-L1 IgV与人硫氧还蛋白(human thioredoxin,hTrx)之间的相互作用情况。方法 利用生物信息学方法对人PD-L1进行分析,并根据NCBI GenBank数据库中登录的PD-L1基因编码区序列设计扩增PD-L1 IgV结构域的引物,以pENTER-PD-L1质粒为模板进行PCR扩增,克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7。将鉴定正确的重组诱饵质粒及pGBKT7空载体分别转化至Y2HGold酵母细胞,PCR及Western blot法检测PD-L1 IgV基因及蛋白的表达;同时检测PD-L1 IgV蛋白毒性及自我激活效应,并采用滴板法检测诱饵蛋白PD-L1 IgV与hTrx相互作用情况。结果 PD-L1的生物信息学分析结果与相关报道一致;成功构建了重组诱饵质粒pGBKT7-PD-L1 IgV,并获得Y2HGold阳性克隆子,PD-L1 IgV能在其中稳定表达。空载体pGBKT7、重组诱饵质粒pGBKT7-PD-L1 IgV在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal平板上生长良好,菌落大小、数量一致,呈白色,在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA平板上两者均不生长,表明PD-L1 IgV蛋白对酵母无毒性且无自我激活效应;滴板法试验结果显示,所有实验组在SD/-Trp/-Leu平板上生长良好,仅阳性对照组可在SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上生长且呈蓝色,表明诱饵蛋白PD-L1 IgV、hTrx不存在自我激活现象,且两者之间也不存在相互作用。结论 成功构建了重组人PD-L1 IgV酵母双杂交诱饵质粒,PD-L1 IgV蛋白对酵母细胞无毒性且无自我激活效应,且与hTrx之间无相互作用。后续可利用hTrx构建肽适体文库,从中筛选可与PD-L1 IgV特异结合的肽适体。