复方健耳剂对C57BL/6J小鼠AHL毛细胞的保护作用

目的探讨老年性耳蜗毛细胞损害与中药复方健耳剂两种喂药方法干预的作用。方法选择1月龄C57BL/6J小鼠22只用于本实验,其中4只小鼠每日饮用自来水直到出生后3个月作为幼龄对照组;6只小鼠每日饮用自来水直到出生后7个月作为老年性聋对照组;6只小鼠每日自动饮用中药复方健耳剂直到出生后7个月;另6只小鼠每日自动饮用同样中药至4个月后改用每日人工灌服直到出生后7个月。各组动物实验到期终止后,取耳蜗进行全耳蜗基底膜铺片,将全耳蜗内、外毛细胞计数结果输入计算机并应用耳蜗图软件进行耳蜗毛细胞密度对比分析,其中选择基底膜上重要的病变区间的毛细胞密度进行统计学分析。结果 3月龄对照组小鼠耳蜗外、内毛细胞缺损仅仅出现在耳蜗底回钩端区域;7月龄对照组外、内毛细胞缺损从底回基底膜起始端扩展到距离耳蜗顶端约40%区域;7月龄中药灌服组和自动饮用组动物的内、外毛细胞缺损范围和程度相似,均显著比7月龄对照组为轻(P<0.001)。结论中药复方健耳剂能够有效延缓C57BL/6J小鼠老年性耳蜗毛细胞损害的发生和发展,两种喂药方式所起作用相同(P>0.05),其药理机制可能与其改善微循环,清除活性氧,保护线粒体等作用相关。

聪耳通窍剂干预豚鼠庆大霉素耳毒性聋作用的机制探讨

目的探讨基于中医脾肾理论的中药聪耳通窍剂干预庆大霉素(gentamycin,GM)耳毒性聋作用与可能机制。方法选择杂色成年豚鼠60只,随机分为正常对照组,GM对照组,中药+GM组,每组各20只。正常对照组按常规饲养至第11天期满;GM对照组按200mg/kg·d剂量,每天分两次连续注射9天,第11天终止饲养;中药+GM组按3.994g/kg·d剂量(1/2人工灌服,1/2自动饮用),预先服用聪耳通窍剂10天,然后在继续服用中药同时开始注射每天同等剂量GM,连续9天,第11天终止饲养。其中每组6只动物于第5、6、9天检测ABR评估听力;6只动物利用RT-PCR检测耳蜗SOD1;剩余8只动物用于全耳蜗基底膜铺片,琥珀酸脱氢酶染色,进行耳蜗毛细胞形态学研究,以及检测血清BUN和Cr,肾脏切片经苏木素-伊红染色,了解肾功能和肾组织病理变化,其中每组6只动物一侧肾脏应用western blot检测ASK-1、Trx、caspase-3。结果正常对照组ABR阈值一直保持相对恒定正常范围。与正常对照组比较,GM对照组ABR阈值第5天即出现明显差异(P<0.05),与中药+GM组比较,第7天开始出现明显差异(P<0.05),随着天数增加,差异继续扩大(P<0.01)。中药+GM组ABR阈值递增差异不显著(P>0.05)。全耳蜗基底膜检查显示,正常对照组各回三排内、外毛细胞形态正常,数量完整,排列有序;GM对照组各回三排外毛细胞损毁严重,绝大部分细胞出现严重崩解不全,或凋亡缩小,但内毛细胞仍基本存在;中药+GM组各回三排外毛细胞除少量和散在崩解不全外,大多仍存留可辨,形态如常,内毛细胞仍保持完整,各回外毛细胞损毁状况明显少于GM对照组(P<0.01)。中药+GM组对耳蜗SOD1表达明显高于正常对照组和GM对照组(P<0.01,P<0.05),而血清BUN和Cr含量则明显低于GM对照组(P<0.01)。肾脏切片染色显示,与正常对照组比较,GM对照组肾小球和近曲肾小管等受损严重,病理改变明显,而中药+GM组则受损不明显,甚至基本保持正常。中药+GM组对肾组织ASK-1、caspase-3表达明显低于GM对照组(P<0.05),对Trx表达则明显高于GM对照组(P<0.05)。结论一定剂量GM连续使用可造成严重耳、肾毒性损害,耳蜗损害以外毛细胞为主要损害靶细胞,肾脏损害以肾小球和近曲小管为主。聪耳通窍剂具有显著防护GM耳、肾毒性损害作用,其作用机制与其抑制氧化应激反应,干预ROS介导的细胞死亡径路有关,而通过护肾,促进GM排泄,是其间接护耳的重要机制;中医脾肾理论防治耳聋具有科学基础和应用价值。

中药复方健耳剂对C57BL/6J小鼠老年性聋的防护效应

目的观察C57BL/6J小鼠老年性听力下降现象并研究中药复方健耳剂对老年性聋小鼠的保护作用及其可能机制。方法将36只C57BL/6J小鼠分为正常对照组（n=6）、老年性聋对照组（n=12）及高剂量中药健耳剂组（简称中药高剂量组,n=12）及低剂量中药健耳剂组（简称中药低剂量组,n=6）。正常对照组小鼠自断奶后每日饮用自来水直至出生后2个月;老年性聋对照组小鼠自断奶后每日饮用自来水直至出生后7个月;中药高、低剂量组小鼠自断奶后分别每日饮用3.65、0.91 g/（kg·d）的中药复方健耳剂直至出生后7个月。每组6只小鼠在实验终止日应用听性脑干诱发电位仪检测小鼠的听性脑干反应（auditory brainstem response,ABR）阈。中药高剂量组与同期老年性聋对照组6只小鼠在终止实验即刻取出耳蜗、听皮层脑组织及肝脏,采用丙二醛考马斯亮蓝试剂盒,利用紫外分光光度计,检测所取组织中丙二醛含量。结果2月龄正常对照组小鼠在4-48 KHz频率范围的不同短纯音诱发的ABR阈值保持正常。与2月龄正常对照组比较,7月龄老年性聋对照组小鼠ABR阈值明显升高（P〈0.05）,与高剂量中药组在8-48 KHz频率范围ABR阈值比较,差异亦有统计学意义（P〈0.05）。与7月龄老年性聋对照组比较,高剂量中药组小鼠耳蜗、听皮层、肝脏组织中丙二醛含量明显降低（P〈0.01）。结论 C57BL/6J小鼠在出生后7个月表现出明显的高频性老年性聋症状。每日饮用高剂量中药健耳剂可显著延缓老年性聋的发生和发展。中药健耳剂保护听觉延缓老年性聋发生的作用,可能与其所含中药的抗氧化效应有关。

复方健耳剂干预庆大霉素耳毒性致豚鼠毛细胞损害的实验研究

目的探讨中药复方健耳剂干预豚鼠庆大霉素(gentamycin,GM)耳毒性致外毛细胞损害的作用及可能机制。方法选择杂色成年豚鼠48只,随机分为正常对照组、GM对照组、复方健耳剂+GM组(简称中药+GM组),每组16只,其中正常对照组按常规饲养至第11天期满;GM对照组按200 mg/(kg·d)剂量,每天分2次连续注射9天,第11天终止饲养;中药+GM组按3.994 g/(kg·d)剂量(1/2人工灌服,1/2自动饮用),预先服用复方健耳剂10天,然后在继续服用中药同时开始注射每天同等剂量GM,连续9天,第11天终止饲养。所有动物期满取出耳蜗,其中每组10只动物用于全耳蜗基底膜铺片,琥珀酸脱氢酶染色,进行耳蜗毛细胞形态学观察,另外每组6只动物,利用Real-time PCR技术检测耳蜗组织硫氧还蛋白(Trx)-1、Trx-2、凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)mRNA表达量。结果全耳蜗基底膜检查显示,正常对照组各回三排内、外毛细胞形态正常,数量完整,排列有序;GM对照组各回三排外毛细胞损毁严重,绝大部分细胞出现严重崩解不全,或凋亡缩小,第1回比其他各回损害较重(P<0.01),但内毛细胞仍基本存在;中药+GM组各回三排外毛细胞除少量和散在崩解不全外,大多仍存留可辨,形态如常,内毛细胞仍保持完整,各回外毛细胞损毁状况明显少于GM对照组(P<0.01)。中药+GM组Trx-1、Trx-2 mRNA表达明显高于GM对照组(P<0.01),ASK1 mRNA表达则明显低于GM对照组(P<0.01)。结论一定剂量GM连续使用可造成豚鼠耳蜗外毛细胞严重损害,并以第1回明显,而且以外毛细胞为主要损害靶细胞。复方健耳剂具有防治GM耳毒性外毛细胞损害作用,其机制可能与其调控硫氧还蛋白系统,阻止ASK1依赖的细胞凋亡有关。

补气剂对豚鼠庆大霉素耳、肾功能损害的干预作用

目的探讨补气剂对豚鼠庆大霉素(GM)耳、肾功能损害的作用及其机制。方法选择健康杂色成年豚鼠36只,随机分为正常组、模型组、补气组各12只,均饲养11天。正常组常规饲养;模型组注射GM[200 mg/(kg·d)]至第9天,每天2次;补气组预先使用补气剂[1.428g/(kg·d)]10天,人工灌服及自动饮用各半,同时注射GM[200 mg/(kg·d)]至第9天,补气剂共使用21天。每组随机选取6只豚鼠于第5、7、9天检测听性脑干反应(ABR);另外6只豚鼠于11天后检测耳蜗毛细胞形态学。11天后检测血清BUN、Cr;肾脏切片苏木素-伊红染色了解肾组织病理变化;Western Blot检测肾组织ASK-1、Trx、HSF-1、Caspase-3蛋白。结果全耳蜗铺片结果显示模型组各回三排外毛细胞损毁严重,肾组织病理显示肾小球弥漫性增大,近曲小管上皮细胞明显浊肿,补气组有所改善。与正常组同期比较,模型组第5、7、9天ABR阈值,血清BUN和Cr水平以及ASK-1、Caspase-3表达升高(P<0.05),各回三排外毛细胞计数以及Trx表达减少(P<0.05)。与模型组比较,补气组各回三排外毛细胞计数以及Trx、HSF-1表达增加(P<0.05),第9天ABR阈值、血清BUN和Cr含量以及ASK-1、Caspase-3表达下降(P<0.05)。与本组第5天比较,模型组和补气组第9天ABR阈值升高(P<0.05)。11天时,与本组第3回比较,模型组和补气组第1回三排外毛细胞减少(P<0.01)。结论补气剂具有一定的保护GM诱导豚鼠耳、肾毒性损害的作用,其机制与抑制氧化应激反应有关。