腰椎间盘突出症活血化瘀治疗的目标蛋白筛选及鉴定

背景活血化瘀属于中医药特色疗法,也是临床上非手术治疗腰椎间盘突出症(LIDP)疗效优良的主要方法之一,既往有学者从病理、影像、免疫及基因等角度开展了大量研究,但有关活血化瘀治疗LIDP机制仍未明了。目的通过同位素标记相对和绝对定量技术(i TRAQ)结合液相色谱与串联质谱(LC-MS/MS)筛选和鉴定LIDP活血化瘀治疗前后差异表达蛋白,筛选LIDP活血化瘀治疗的目标蛋白。方法选取2013年7月—2014年12月于广西中医药大学第一附属医院治疗的血瘀证LIDP患者30例为研究对象,予活血化瘀治疗4周,观察患者临床疗效。分别于治疗前后提取患者外周血血清,通过去除高丰度蛋白、测定蛋白浓度、酶解蛋白、肽段i TRAQ标记、高效液相色谱分离、LC-MS/MS分析等程序和方法,筛选及鉴定治疗前后的差异表达蛋白。结合基因本体论注释及KEGG通路分析相关生物信息学,对差异蛋白的功能和代谢通路进行分析。结果治疗后临床控制19例,显效8例,有效2例,无效1例,总有效率为96.7%(29/30)。i TRAQ联合LC-MS/MS鉴定到300个蛋白质组,其中209个蛋白各通道标记标签均有定量信息,筛选出20个差异表达蛋白,其中呈上调表达及下调表达的差异蛋白各10个。本研究对20个差异蛋白的KEGG富集结果显示,9个差异蛋白富集到27条信号通路。补体和凝血级联反应富集到3个差异蛋白,PPAR信号通路、百日咳、美洲锥虫病、金黄色葡萄球菌感染及系统性红斑狼疮富集到2个差异蛋白。百日咳、美洲锥虫病、金黄色葡萄球菌感染及系统性红斑狼疮等11条信号通路富集到补体C3,PI3K-Akt信号通路、黏着斑、肌动蛋白细胞骨架调节等9条信号通路富集到纤维连接蛋白1。结论活血化瘀治疗血瘀证LIDP效果显著;载脂蛋白A1、载脂蛋白M、载脂蛋白C3、纤维连接蛋白1及补体C3很可能是血瘀证LIDP选用活血化瘀治疗的潜在血清靶蛋白。

癌-睾丸抗原GAGE-1基因的重组、表达及纯化

目的为进一步研究临床应用癌-睾丸抗原GAGE-1诱导特异性抗肿瘤免疫反应,对GAGE-1基因进行克隆、体外原核重组表达及蛋白分离纯化。方法运用RT-PCR技术从人QGY-7701肝癌细胞株中扩增GAGE-1基因片段,插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GAGE-1,并导入大肠杆菌BL21,IPTG诱导目的蛋白表达;经包涵体透析复性及GST柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析鉴定。结果扩增得到GAGE-1基因5’端251 bp片段,与GeneBank公布的序列一致,构建的PGEX-6p-1-GAGE-1原核表达质粒经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达分子量约35.7 kD的GST-GAGE-1融合蛋白,纯化后蛋白纯度为90%以上。结论成功构建PGEX-6p-1-GAGE-1重组表达质粒,并成功表达纯化了GST-GAGE-1融合蛋白,为进一步深入研究GAGE蛋白奠定了基础。