27nt-miRNA通过靶向哺乳动物雷帕霉素靶蛋白调控血管平滑肌细胞凋亡及其分子机制研究

目的:探讨来源于一氧化氮合酶基因第四内含子的27碱基重复序列微小RNA(27nt-miRNA)对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)介导的主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡调控作用及潜在分子机制。方法:将大鼠主动脉VSMC分为空白对照组、雷帕霉素组、27nt-miRNA组、27nt-miRNA反义序列(anti-27ntmiRNA)组、阴性对照组。27nt-miRNA组:转染27nt-miRNA正义链慢病毒载体;anti-27nt-miRNA组:转染27ntmiRNA反义链慢病毒载体;阴性对照组:转染随机阴性序列慢病毒载体。除空白对照组外,雷帕霉素组与各转染组细胞给予100 ng/ml雷帕霉素诱导培养2 h诱导凋亡。荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)验证27nt-miRNA慢病毒稳转细胞株构建情况;CCK-8法、流式细胞术、qRT-PCR法与蛋白免疫印迹(Western blot)法分别检测各组细胞增殖能力、细胞凋亡率与周期分布以及mTOR、磷酸化-mTOR(p-mTOR)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的信使RNA(mRNA)和(或)蛋白表达水平。结果:慢病毒转染VSMC后,27nt-miRNA稳转细胞株构建成功,雷帕霉素可抑制VSMC的mTOR mRNA与p-mTOR蛋白表达水平。与阴性对照组相比,27nt-miRNA组细胞的活力与增殖能力显著增强,且细胞凋亡率显著降低(P均<0.05),细胞周期G1期向S期分裂进程阻滞减弱(P<0.05);Bax和caspase-3蛋白表达量显著减少,Bcl-2蛋白表达量显著增加(P均<0.05);mTOR基因转录水平与p-mTOR蛋白表达水平均下降(P<0.05)。结论:27nt-miRNA通过负调控m TOR基因转录水平与蛋白磷酸化水平抑制VSMC凋亡,其机制可能与上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax和caspase-3蛋白表达有关。

27nt-miRNA对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的:探讨27nt-miRNA(27nt-miR)对氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HU⁃VECs)凋亡的影响及分子机制。方法:体外培养HUVECs,分为正常对照组、Ox-LDL组、27nt-miR+Ox-LDL组、anti-27nt-miR+Ox-LDL组和阴性对照+Ox-LDL组。正常对照组给予正常培养;Ox-LDL组用40 mg/L Ox-LDL作用48 h诱导细胞凋亡;27nt-miR+Ox-LDL组、anti-27nt-miR+Ox-LDL组及阴性对照+Ox-LDL组分别以相同的操作方法转染相应慢病毒质粒后用40 mg/L Ox-LDL作用48 h诱导细胞凋亡。采用CCK-8法检测细胞活力,划痕实验检测细胞的迁移能力,caspase-3活性试剂盒检测细胞内caspase-3活性,RT-qPCR法和Western blot法检测细胞内Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA及蛋白的表达情况。结果:与阴性对照+Ox-LDL组相比,27nt-miR+Ox-LDL组HUVECs的27ntmiR高表达可显著降低细胞活力和迁移能力(P<0.05),显著增加Ox-LDL所致的caspase-3活性和细胞凋亡(P<0.05),亦可显著上调Ox-LDL所致的Bax和caspase-3 mRNA和蛋白表达(P<0.05),下调Bcl-2的mRNA和蛋白表达(P<0.05);而anti-27nt-miR+Ox-LDL组,上述所测指标均表现出相反趋势。结论:27nt-miR可能通过调控Bax、cas⁃pase-3和Bcl-2凋亡/抗凋亡蛋白的表达促进Ox-LDL体外诱导的HUVECs凋亡进而抑制HUVECs活力和迁移。

27nt-miRNA对过氧化氢诱导血管平滑肌细胞凋亡的影响及分子机制

目的:探讨27nt-miRNA对经过氧化氢(H_(2)O_(2))处理的血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡、活力和迁移的影响及作用机制。方法:将大鼠主动脉VSMCs分为5组:空白对照组、H_(2)O_(2)组、anti-27nt-miRNA+H_(2)O_(2)组、阴性对照+H_(2)O_(2)组和27nt-miRNA+H_(2)O_(2)组。空白对照组:不做任何处理;H_(2)O_(2)组:用500μmol/L H_(2)O_(2)处理6 h诱导细胞凋亡;anti-27nt-miRNA+H_(2)O_(2)组:转染27nt-miRNA反义序列慢病毒载体后,用500μmol/L H_(2)O_(2)处理6 h诱导细胞凋亡;阴性对照+H_(2)O_(2)组:转染随机阴性序列慢病毒载体后,用500μmol/L H_(2)O_(2)处理6 h诱导细胞凋亡;27nt-miRNA+H_(2)O_(2)组:转染27nt-miRNA高表达慢病毒载体后,再用500μmol/L H_(2)O_(2)处理6 h诱导凋亡。使用细胞计数试剂盒(CCK-8)法和流式细胞术检测VSMCs存活率、凋亡率,划痕实验检测细胞迁移率,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果:与空白对照组比较,H_(2)O_(2)组细胞活力和迁移率降低(P<0.05)、细胞凋亡率上升(P<0.05),提示成功构建VSMCs凋亡模型。对比阴性对照+H_(2)O_(2)组,27nt-miRNA+H_(2)O_(2)组可抑制细胞的活力和迁移能力(P<0.05),且细胞凋亡率上升(P<0.05),凋亡相关蛋白Bax表达水平上升,Bcl-2表达水平下降(P<0.05),而anti-27nt-miRNA+H_(2)O_(2)组细胞凋亡率降低、细胞活力和迁移率增加,Bax蛋白表达水平降低,Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:过表达27nt-miRNA可促进H_(2)O_(2)所诱导的VSMCs凋亡和抑制其活力和迁移能力,其机制可能与凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达改变密切相关。

miR-24对氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞炎症损伤的影响

目的探讨microRNA-24(miR-24)对氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎症损伤的影响及潜在分子机制。方法采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测HUVECs的增殖;Transwell试验检测HUVECs的迁移能力;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-24、炎症因子白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和细胞黏附分子(ICAM)-1的mRNA表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-6和TNF-α的蛋白表达;Western印迹法检测ICAM-1和NF-κB信号通路蛋白的表达情况。结果Ox-LDL刺激HUVECs过量表达炎症因子IL-6、TNF-α和ICAM-1(均P<0.05),且显著增加NF-κB通路磷酸化(p)P65的表达(P<0.05)。miR-24过表达可显著抑制HUVECs的增殖和迁移(P<0.05),亦可显著抑制Ox-LDL引起的IL-6、TNF-α和ICAM-1表达的增加及降低pP65的分泌(均P<0.05)。抑制miR-24的表达,上述所测指标均表现出相反的趋势。结论miR-24保护HUVECs免受Ox-LDL诱导的炎症损伤,其潜在分子机制可能与其抑制NF-κB信号通路激活有关。

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨27nt-miRNA对血管平滑肌细胞自噬的调控作用

目的探讨27nt-miRNA对西罗莫司诱导的血管平滑肌细胞自噬的调控作用及分子机制。方法将大鼠主动脉血管平滑肌细胞分为正常组、西罗莫司组、27nt-miRNA组、anti-27nt-miRNA组和阴性对照组。正常组给予正常培养;西罗莫司组用100 nmol·L^-1西罗莫司作用6 h建立自噬模型;27nt-miRNA组、anti-27nt-miRNA组及阴性对照组先转染相应慢病毒载体,待转染成功后用100 nmol·L^-1西罗莫司作用6 h建立自噬模型。用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法验证27nt-miRNA慢病毒稳转细胞株构建情况,用透射电镜观察5组细胞内部自噬小体数量,用四甲基偶氮唑盐法检测5组细胞活性,用Western blot法与qRT-PCR法检测LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的蛋白和mRNA表达水平。结果慢病毒转染细胞成功后27nt-miRNA的表达受到影响;与阴性对照组相比,细胞内自噬小体及自噬溶酶体显著增多,27nt-miRNA组细胞的活性显著增强[(0.90±0.03)vs.(0.72±0.01),P<0.05],LC3-Ⅰ/Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达量均显著增加[(1.92±0.21)vs.(1.59±0.09),(9.47±0.61)vs.(7.19±1.32),均P<0.05],LC3-Ⅱ和Beclin-1的mRNA表达量均显著增加[(1.83±0.33)vs.(1.27±0.19),(1.77±0.29)vs.(1.36±0.23),均P<0.05],PI3K/Akt/mTOR信号通路被抑制;与此同时,anti-27nt-miRNA组细胞质内自噬小体及自噬溶酶体显著减少,且细胞活性显著性降低[(0.60±0.03)vs.(0.72±0.01),P<0.05],LC3-Ⅱ和Beclin-1的mRNA相对表达量均显著下降[(0.90±0.25)vs.(1.27±0.19),(0.98±0.24)vs.(1.36±0.23),均P<0.05]。结论过表达27nt-miRNA可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路促进血管平滑肌细胞自噬进而引起细胞过度增殖,27nt-miRNA可能成为心血管疾病的潜在治疗靶点。

牛大力水提取物抗大鼠肝纤维化作用的研究

目的:探究壮药牛大力抗大鼠肝纤维化作用及其作用机制。方法:开展体外细胞实验,利用CCK8法观测牛大力水提物对肝星状细胞(HSC)增殖的抑制作用,运用流式细胞仪检测HSC的凋亡情况。体内动物实验则采用复合因素制备肝纤维化大鼠模型,灌胃给予牛大力水提物3周后,测定血清中Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、层黏蛋白(LN)、谷胱甘肽(GSH)以及转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))、肿瘤坏死因子-α(TNT-α)的蛋白表达,并观察肝组织的病理变化。结果:在体外细胞实验中,牛大力水提物能抑制HSC的增殖,诱导HSC发生凋亡,且随着水提物浓度增加作用增强。而在动物体内实验中,牛大力水提物组的LN水平显著降低,GSH的水平显著增加(P<0.01),但只有高、中剂量组的Ⅳ-C水平出现显著性降低(P<0.01)。另外,高剂量组的TGF-_(1)表达减少(P<0.05)。通过Masson染色和HE染色发现,牛大力水提物能改善肝纤维化大鼠肝组织的病变程度。结论:牛大力水提物具有抗肝纤维化作用。

27nt-miRNA对氧化低密度脂蛋白介导的血管内皮细胞管腔形成活性减弱的影响及其分子机制

目的探讨27nt-miRNA对氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)介导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移和管腔形成能力减弱的影响及相关分子机制。方法将HUVECs分为正常对照组、Ox-LDL组、27nt-miRNA组、27nt-miRNA反义序列(anti-27nt-miRNA)组和miR-NC组。正常对照组不做任何处理;Ox-LDL组用40μg·mL^(-1) Ox-LDL作用48 h;27nt-miRNA组、anti-27nt-miRNA组和miR-NC组分别感染27nt-miRNA高表达、27nt-miRNA反义序列和随机阴性序列的慢病毒载体后,再用40μg·mL^(-1) Ox-LDL作用48 h。采用qRT-PCR法检测27nt-miRNA表达水平;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;Matrigel实验检测细胞的成管能力;一步法检测细胞的一氧化氮产量;Western blot法和qRT-PCR法检测p-PI3K、PI3K、Akt、p-Akt、eNOS的蛋白和(或)mRNA表达水平。结果与miR-NC组相比,27nt-miRNA组细胞27nt-miRNA高表达(P<0.05)、细胞活力下降(P<0.05)、细胞迁移能力降低(P<0.05),且未见管腔样网络结构;此外,27nt-miRNA组细胞NO的产量显著降低(P<0.05),PI3K、Akt与eNOS的mRNA表达量显著降低(P<0.05),p-PI3K、p-Akt与eNOS的蛋白表达量显著降低(P<0.05);anti-27nt-miRNA组细胞的上述指标均较27nt-miRNA组与miR-NC组升高(P<0.05)。结论在Ox-LDL诱导HUVECs损伤后,27nt-miRNA可能通过抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路的激活,抑制HUVECs的增殖和迁移,继而抑制血管形成,可能参与血管疾病的病理生理过程。