海藻糖在生物组织器官保护方面的新应用

海藻糖是具有独特生物学功能的二糖,它在生物活性材料的保护保存等方面起着不可估量的作用,是一种非常优良的生物活性保护剂。综述了海藻糖在血液、脂质体、气管、肝、肺、肾、胚胎等器官保护中的应用情况及新的发展动态。

水牛黑色素皮质素1受体基因克隆、生物信息学分析及表达模式研究

本试验旨在对水牛黑色素皮质素1受体(MC1R)基因进行克隆、生物信息学分析及表达模式研究。参考牛MC1R基因(GenBank登录号:JN123363.1)序列设计引物,以本地沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增克隆MC1R基因片段并进行测序分析。运用QRT-PCR方法检测摩拉水牛、沼泽水牛、白沼泽水牛和黄牛皮肤组织中MC1R基因的表达模式,并通过Western blotting方法检测沼泽水牛和白沼泽水牛MC1R基因的蛋白表达差异。结果表明,应用PCR方法成功克隆了水牛MC1R基因,其编码区全长954bp,共编码317个氨基酸。测序分析后发现沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛MC1R基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似性很高。沼泽水牛与白沼泽水牛在476、618、881、930和931bp位点上分别发生T→C、G→C、G→A、G→A和A→G突变,导致了沼泽水牛和白沼泽水牛第159位氨基酸由丝氨酸变成苯丙氨酸,第310位氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸,第294位氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸,发生了非同义突变。QRT-PCR结果发现,MC1R基因在摩拉水牛、沼泽水牛和黄牛皮肤组织中的相对表达量均显著高于白沼泽水牛(P<0.05);Western blotting分析结果显示,沼泽水牛皮肤组织中MC1R蛋白的表达量高于白沼泽水牛。综上所述,白沼泽水牛MC1R基因的编码区发生氨基酸位点突变,且相对表达量和蛋白表达量均低于沼泽水牛,推测此为白沼泽水牛体内合成的黑色素缺失而导致毛色白化的主因。

广西巴马小型猪MyoD1基因克隆及其真核表达载体的构建

本研究旨在对广西巴马小型猪成肌细胞决定基因1(myoblast-determining 1,MyoD1)进行克隆分析,并构建MyoD1基因真核表达载体pEGFP-N1-MyoD1,为进一步研究该基因在广西巴马小型猪骨骼肌发育中的调控作用奠定基础。以广西巴马小型猪的肝脏组织为材料,应用RT-PCR技术克隆得到广西巴马小型猪MyoD1基因编码序列,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建该基因的真核表达载体,经过PCR和双酶切验证,通过脂质体转染,将重组质粒转染C2C12细胞,在细胞水平验证了该载体的正确性。结果显示,广西巴马小型猪MyoD1基因编码区序列长960 bp,编码319个氨基酸,核苷酸序列与猪、牛、水牛、绵羊、马、人、小家鼠、褐家鼠、家犬的同源性依次为99.7%、92.8%、92.9%、92.6%、91.5%、82.9%、82.9%、82.0%和90.9%;系统进化树分析表明,广西巴马小型猪MyoD1基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;蛋白质结构分析表明,MyoD1蛋白为膜外蛋白,在第4-116位氨基酸处存在1个MyoD家族标志性的MyoD结构域,对广西巴马小型猪、猪和人的MyoD1蛋白高级结构比较发现其具有极高的相似性。本研究构建的广西巴马小型猪MyoD1基因表达载体pEGFP-N1-MyoD1,转染C2C12细胞后产生绿色荧光信号,表明MyoD1基因在C2C12细胞中成功表达。

线粒体移植对水牛卵母细胞发育潜能的影响

本研究以水牛卵泡颗粒细胞作为线粒体的来源细胞,初步探讨水牛卵母细胞进行线粒体移植(MIT)后对其发育潜能的影响。试验比较了不同级别水牛卵母细胞mtDNA的拷贝数,并研究了水牛卵母细胞进行MIT后,其后续早期胚胎发育及胚胎线粒体膜电位(ΔΨm)的变化情况。结果显示:一级卵母细胞组的平均mtDNA拷贝数极显著高于二、三级卵母细胞组((202 101±74 432)vs(118 483±17 028),(39 177±7 938),P<0.01),二级卵母细胞组的平均mtDNA拷贝数极显著高于三级卵母细胞组((118 483±17 028)vs(39 177±7 938),P<0.01);孤雌激活处理后发现:一级卵母细胞组的卵裂率和囊胚率也都极显著高于二、三级卵母细胞组(P<0.01),而二级卵母细胞组激活后胚胎的卵裂率和囊胚率亦极显著高于三级卵母细胞组(P<0.01)。用Mito-Tracker探针标记的外源线粒体经移植后,会随着胚胎的发育而发生移动,分布到各个卵裂球中;且发现二级卵母细胞MIT组孤雌激活后的囊胚率显著高于对照组和空注组(27.3%vs 17.4%,7.84%,P<0.05),而三级卵母细胞MIT组激活后的囊胚率与对照组和空注组差异不显著(P>0.05);对胚胎ΔΨm检测发现,水牛植入前各时期胚胎ΔΨm总体呈上升趋势,线粒体移植后胚胎各时期的ΔΨm均显著高于对照组(P<0.05)。综上表明:不同质量的水牛卵母细胞其mtDNA拷贝数存在显著差异,且mtDNA拷贝数与卵母细胞质量和发育能力成正相关;通过移植外源线粒体可以提高二级水牛卵母细胞的发育潜能。

不同精子处理对应用ICSI-Tr技术生产转基因水牛胚胎效率的影响

本文主要探讨了不同精子处理对应用显微授精介导(intracytoplasmic sperm injection-mediated trans-genesis,ICSI-Tr)生产转基因水牛胚胎效率的影响。本试验以p18T-BCN5.2-IFN-1.1pA-EGFP为载体,比较了精子的不同处理方式(NaOH和冻融)、NaOH处理精子不同时间(5min,10min,20min,30min和60min)以及不同外源DNA浓度(5ng/μL,10ng/μL,25ng/μL和50ng/μL)对ICSI-Tr转基因效率的影响。结果显示:NaOH处理组的囊胚EGFP表达率(46.1%),与冻融精子处理组(47.1%)差异不显著,但发育率显著高于冻融处理精子组(28.3%vs16.7%,P<0.05)。处理60min组和30min组的分裂率分别为78.9%和77.5%,显著高于20min、10min和5min组的64.0%、60.0%和64.0%(P<0.05),其中30min处理组的囊胚EGFP表达率高达44.4%,显著高于其它处理组(P<0.05)。25ng/μL组和50ng/μL组的早期胚胎EGFP表达效率差异不显著(41.3%vs42.5%),但显著高于5ng/μL组和10ng/μL组(22.5%和35.5%),25ng/μL组的囊胚EGFP表达效率显著高于其它组(P<0.05)。本研究优化了应用ICSI-Tr生产转基因水牛胚胎技术体系,为获得ICSI-Tr转基因水牛奠定了良好的工作基础。

水牛卵巢颗粒细胞的分离培养及凋亡测定

研究主要是通过比较水牛卵巢颗粒细胞在不同培养基中的生长状态,并对细胞的增殖、核型及凋亡情况进行检测,以了解水牛卵巢颗粒细胞体外生长特性,建立水牛卵巢颗粒细胞的体外培养体系。结果发现,分离获得的水牛卵巢颗粒细胞存活率约为60%;采用DMEM培养基,颗粒细胞的生长速度和生长状态优于TCM-199和DMEM/F12培养基;细胞培养24h后开始零星增殖,3～5d增殖速度达到高峰;第1、3、5、7代颗粒细胞正常核型比率差异不显著,均在85%以上;第1代颗粒细胞的凋亡率与第5代差异显著(P<0.05),与第7代差异极显著(P<0.01)。结果表明,DMEM培养基更适宜用于水牛颗粒细胞的体外培养;水牛颗粒细胞能稳定地进行传代培养,染色体的数目不会发生明显改变,但细胞凋亡率会随着培养代数的增加而明显升高。

沼泽型水牛ALK3基因克隆分析与表达模式研究

试验旨在对沼泽型水牛ALK3基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在水牛组织中的表达规律进行系统研究。根据GenBank中已公布的牛ALK3基因序列设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增、克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法分析和预测了水牛ALK3的遗传进化及蛋白质的理化性质、二级和三级结构;并应用QRT-PCR技术对ALK3基因在水牛组织中的表达进行了差异分析。结果表明,水牛ALK3基因编码区全长1 599bp,共编码532个氨基酸。多重序列比较分析显示,水牛ALK3核苷酸序列与牛、绵羊、猪、马、人和小鼠相应序列的同源性分别为98%、96%、95%、93%、94%和91%。系统进化树分析显示,ALK3基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。对ALK3蛋白质的分析表明该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在丝氨酸/苏氨酸激酶和GS等结构。定量分析结果显示,ALK3在水牛生殖脊、心脏、肝脏、颗粒细胞、肺脏、卵丘细胞、肾脏、下丘脑、垂体、大脑等15种组织或细胞中有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,垂体、肺脏和睾丸次之,卵丘细胞表达量最低。本研究成功克隆了沼泽型水牛ALK3基因,并研究了其在不同水牛组织细胞中的表达规律,为阐明其在水牛繁殖过程中的功能及转基因载体构建中的应用研究奠定了理论基础。

水牛转录抑制因子CTCF基因克隆分析及不同组织中的表达研究

本研究克隆了水牛转录抑制因子CTCF基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还对CTCF基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了长2239bp水牛CTCF基因序列,其中编码区全长2184bp,编码727个氨基酸,理论蛋白质分子质量82.7ku,等电点为6.57。多重序列比较分析显示,水牛CTCF核苷酸序列与牛、猪、马、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、96%、96%、94%和92%,结合系统进化树分析结果推测,CTCF基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛CTCF蛋白的二级和三级结构分析结果发现,其存在连续11个锌指C2H2结构,预测其为重要的DNA结合蛋白。定量表达分析结果显示,CTCF在水牛肝脏组织中相对表达量最高,大脑、肌肉和肾脏次之,卵巢和皮肤表达量较低。

水牛受精卵胞质内注射转基因的初步研究

[目的]旨在探讨通过向水牛受精卵胞质内注射外源DNA实现转基因的可行性。[方法]水牛卵母细胞体外成熟20～22 h后随机分为2组:①在体外受精7～10 h或18～20 h后向卵胞质内注入约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA溶液;②分别注入单个精子与约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA混合物,观察外源基因在胚胎发育过程中的表达情况。[结果]受精卵胞质内注射的早期胚胎基因表达率、囊胚基因表达率与ICSI-Tr差异不显著(P>0.05),且IVF 7～10 h时注射的分裂率、早期胚胎基因表达率均显著高于18～20 h(P<0.05)。[结论]水牛IVF受精卵胞质内注射外源基因能获得转基因胚胎,且IVF后7～10 h注射的效果优于IVF后18～20 h注射。

不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响

本研究探讨了不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响。水牛体外成熟卵进行ICSI介导转基因(ICSI-mediated gene transfer,ICSI-Tr)操作后,先用5μmol/L的离子霉素(ionomycin,Ion)激活处理5min,然后分成3组,再分别用10μg/mL放线菌酮(cycloheximide,CHX)培养5h(CHX5h组)、10μg/mLCHX培养3h后再用2mmol/L的二甲氨基嘌呤(6-DMAP)培养2h(CHX3h-DMAP2h组)或用培养液(CM)培养3h后再用2mmol/L6-DMAP培养2h(CM3h-DMAP2h组)。结果显示,CHX5h组的分裂率、早期胚胎基因表达率和囊胚发育率最高,且显著高于CM3h-DMAP2h组(66.7%比49.5%,p<0.05;66.7%比40.0%,p<0.01;22.2%比9.9%,p<0.05)。ICSI18h后检查原核形成率,发现CHX5h和CHX3h-DMAP2h处理组的完整精子头百分率显著低于CM3h-DMAP2h处理组(p<0.05),2原核(pronucleus,PN)百分率则显著提高(42.4%比23.8%,p<0.05;44.6%比23.8%,p<0.01)。以上结果表明,在水牛ICSI介导转基因时,Ion联合CHX较Ion联合6-DMAP激活重构胚效果好。

水牛ALK5基因克隆分析与组织表达模式研究

为了阐明水牛ALK5基因在水牛卵泡发生过程中的作用,了解其在水牛不同组织中的表达模式,试验采用了RT-PCR及QRT-PCR方法对ALK5基因进行了研究,参考已公布的Gen Bank中牛ALK5基因序列,设计特异性引物应用RT-PCR方法扩增克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法,系统分析和预测了水牛ALK5基因的遗传进化、蛋白质的理化性质、二级和三级结构,并应用QRT-PCR技术对ALK5基因在水牛组织的表达进行了差异分析。结果表明:水牛ALK5基因的编码区全长为1 512 bp,共编码503个氨基酸;水牛ALK5核苷酸序列与牛、绵羊、猪、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、97%、95%、93%和90%,结合系统进化树分析结果推测ALK5基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性;该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在low complexity和GS结构,呈典型跨膜蛋白结构;水牛ALK5基因在肺脏、垂体、下丘脑组织中不表达,在水牛大脑、肝脏、骨骼、卵巢、肌肉和心脏等12个组织细胞中具有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,心脏和肾脏次之,肌肉表达量最低。说明试验成功地克隆了沼泽型水牛ALK5基因,其具备典型的TGF-β受体家族结构,表达具有一定的组织特异性。

丙戊酸处理对猪手工克隆重构胚体外发育潜能的影响

为探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(valproic acid,VPA)对猪手工克隆(HMC)胚胎发育潜能的影响,本研究比较了不同浓度(0、25、50、75和100nmol/L)VPA处理猪HMC重构胚对后期胚胎发育率、内细胞团数和组蛋白乙酰化程度的影响。结果表明,50、75nmol/L VPA处理组HMC重构胚的卵裂率和囊胚发育率均显著高于0、25和100nmol/L VPA处理组(P<0.05);与0、25、75和100nmol/L相比,50nmol/L VPA处理组能显著提高囊胚内细胞团细胞数(P<0.05),囊胚阶段VPA处理组的组蛋白H3K14乙酰化(AcH3K14)水平高于空白组和孤雌激活囊胚。因此,应用VPA处理可提高猪HMC重构胚胎分裂率、囊胚率及增加内细胞团细胞数,提高了猪HMC胚胎的体外发育潜能。

水牛Sohlh2基因的克隆分析及其表达

为阐明广西沼泽型水牛Sohlh2基因在水牛不同组织中的表达规律,根据Gen Bank已公布的牛Sohlh2基因序列,设计其编码区(CDS)扩增引物,应用RT-PCR方法扩增克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法,系统分析了水牛Sohlh2的遗传进化以及蛋白质的理化性质、二级和三级结构;并应用RT-QPCR技术对Sohlh2基因在水牛组织(器官)的表达进行了分析。结果表明:水牛Sohlh2基因编码区全长1 281 bp,共编码426个氨基酸。多重序列比较分析结果显示水牛Sohlh2核苷酸序列与牛、绵羊、山羊、猪、马、人和小鼠相应序列的相似性分别为98%、96%、96%、85%、86%、81%和72%,系统进化树显示Sohlh2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。Sohlh2蛋白质呈弱碱性,无信号肽,在细胞中亚定位于细胞核中,存在b HLH结构。水牛Sohlh2基因在水牛垂体、大脑、肝脏、骨骼、卵巢和睾丸等11个组织(器官)细胞中具有不同程度的表达,其中睾丸细胞中表达量最高,垂体和生殖脊细胞中表达量次之,卵丘细胞中表达量低,心脏、肺脏、肌肉细胞和颗粒细胞中不表达。

Preliminary Study on Transgenesis by Injecting Exogenous DNA into Zygote Cytoplasm of Buffalo

[Objective] This study aimed to investigate the feasibility of transgenesis by injecting exogenous DNA into zygote cytoplasm of Buffalo. [Method] Buffalo oocytes were randomly divided into two groups 20-22 h after in vitro maturation. One group of oocytes was introduced with about 7.5 pl of 50 μg/ml DNA solution containing linear EGFP fragment by cytoplasmic injection 7-10 h or 18-20 h after in vitro fertilization （IVF）; the other group of oocytes was introduced with mixture of a single buffalo sperm and about 7.5 pl of 50 μg/ml DNA solution containing linear EGFP fragment by cytoplasmic injection （generally called ICSI-Mediated Gene Transfer, ICSI-Tr）. Expression of exogenous DNA was observed and recorded during the process of embryonic development. [Result] Early embryonic gene expression efficiency and blastocyst gene expression efficiency in IVF injection group showed no significant difference compared with that in ICSI-Tr group （P0.05）. In addition, the cleavage rate and early embryonic gene expression efficiency in IVF injection group were significantly higher with injection at 7-10 h post IVF than that at 18-20 h post IVF （P0.05）. [Conclusion] These results indicate that transgenic buffalo embryos can be generated by injecting exogenous DNA into cytoplasm of IVF oocytes, and the optimal injection time is 7-10 h post IVF.

米非司酮对小鼠精子穿透卵丘细胞层的影响

本研究旨在探讨米非司酮(mifepristone,RU486)对小鼠精子穿透卵丘细胞层的影响。分别添加20μg/mL RU486到精子获能液或穿卵培养液,检测小鼠精子顶体反应发生比率和穿透卵丘细胞层能力。结果显示,添加RU486能够极显著抑制孕酮(P4,5μg/mL)诱导的精子顶体反应(P<0.01);并极显著减少穿透卵丘细胞层到达卵子透明带的精子数量及在卵子-卵丘细胞复合体(OCC)中精子发生顶体反应的比率(P<0.01);同时添加P4和RU486情况下,相比单独添加RU486,虽然P4能够极显著地促进精子穿透卵丘细胞层到达透明带,但对OCC中的精子顶体反应没有明显作用。综上表明,RU486能够抑制P4诱导的顶体反应并影响小鼠精子穿透卵丘细胞层过程,揭示P4/孕酮受体(PGR)通路在小鼠精子穿卵过程中具有重要作用。

牛磺熊脱氧胆酸对黄牛体外受精早期胚胎发育的影响

旨在研究牛磺熊脱氧胆酸(Tauro ursodeoxychollc acid,TUDCA)对黄牛体外受精(IVF)早期胚胎发育的影响。采用RT-PCR法检测黄牛IVF胚胎早期发育各时期XBP-1mRNA剪接激活情况,随后分别用添加不同浓度(0、100、250、500、1 000μmol·L-1)TUDCA的培养液培养胚胎,分别统计胚胎分裂率、囊胚率、囊胚细胞总数及囊胚细胞凋亡率,采用qRT-PCR法分析囊胚内质网应激相关基因Grp78、Chop、Bax、Bcl-2的表达情况。结果表明,在胚胎的4-细胞、桑椹胚、囊胚检测到XBP-1mRNA明显剪接;IVF胚胎经不同浓度TUDCA培养后各组间的胚胎分裂率差异不显著(P>0.05),但500μmol·L-1 TUDCA组提高了胚胎的囊胚发育率及囊胚细胞数(P<0.05),并降低了囊胚细胞凋亡率(P<0.05);qRT-PCR检测表明,500μmol·L-1 TUDCA处理组下调了囊胚Chop基因的表达,且上调了Bcl-2基因的表达(P<0.05),而Grp78与Bax表达与对照组相比差异不显著(P>0.05)。综上表明:早期胚胎体外发育过程中,存在内质网应激反应;胚胎培养液中添加500μmol·L-1 TUDCA,可以降低内质网应激反应,有利于促进黄牛胚胎发育。

DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR对多能基因及甲基化相关基因在徒手克隆胚胎中表达模式的影响

本试验通过实时荧光定量PCR方法对多能基因Oct4和Nanog及DNA甲基化相关基因Dnmt1和Tets在徒手克隆(handmade cloning,HMC)胚胎中的表达模式进行初步研究,并探讨5-Aza-CdR处理重构胚对这些基因表达模式的影响。结果显示,Oct4、Nanog和Tet3的表达在2细胞时期达到顶峰,Dnmt1和Tet2基因的表达随HMC胚胎发育而下降,而Tet1基因随HMC胚胎发育表达上升。使用5-Aza-CdR处理重构胚没有改变Oct4、Tet1和Tet3基因的表达模式,使Nanog基因在胚胎发育初期表达增加,Dnmt1和Tet2基因在胚胎发育初期表达降低。研究初步确立了Oct4、Nanog、Dnmt1和Tets基因在HMC胚胎的表达模式,5-Aza-CdR对重构胚的处理可对HMC胚胎的甲基化模式产生影响。

增殖细胞核抗原在水牛腔前卵泡中的表达与卵巢组织定位

【目的】探讨在水牛中增殖细胞核抗原(PCNA)参与卵泡发生的时期及其在卵巢组织不同时期卵泡中的表达定位;【方法】采用石蜡切片结合免疫组化的方法对PCNA在卵巢组织中进行定位,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)技术检测PCNA在腔前卵泡中的表达情况。【结果】免疫组化结果显示:原始卵泡中的卵母细胞能检测到PCNA的表达,但颗粒细胞并未观察到PCNA的免疫染色;初级卵泡到次级卵泡,卵母细胞和颗粒细胞中均可检测到PCNA的表达,且在颗粒细胞中的表达有增强的趋势;有腔卵泡中,颗粒细胞、卵泡膜细胞及包围卵母细胞的卵丘细胞中都能观察到很强的免疫染色。定量表达检测结果显示:PCNA在原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡中的表达呈上升趋势,并且有显著差异(43.50333±0.138338 vs 1.633804±0.093796 vs 1±0.012219,P<0.01);【结论】从初级卵泡开始在颗粒细胞中能检测到PCNA的表达,并且其表达随着卵泡的发育有明显的增强趋势,腔前卵泡中PCNA表达的QRT-PCR测定结果与免疫组化结果相一致,研究结果为阐明PCNA参与卵泡发生的分子调控机制奠定了基础。

水牛孤雌胚胎印迹基因IGF2甲基化的研究

为了研究胰岛素样生长因子2(IGF2)如何调控早期胚胎的发育情况,试验采用亚硫酸盐修饰的方法并结合特异性PCR技术检测IGF2的调控区域在水牛孤雌胚胎的2-细胞、8-细胞、桑椹胚(morula)以及囊胚(blastocyst)时期甲基化水平的表达情况。结果表明:该基因的调控区域在孤雌激活胚胎发育的这几个时期甲基化水平差异不显著(P>0.05)。说明该区域的序列在孤雌胚胎的发育过程中没有发生甲基化修饰的变化。

应用ICSI技术生产转基因水牛胚胎的初步研究

本研究旨在探讨水牛精子完整质膜和破损质膜的方法对水牛单精子注射(ICSI)技术转基因效果的影响。水牛精子经冻融、Triton×-100、超声波3种方法破损精子质膜后与外源质粒DNA混合,采用ICSI的方法将基因转染后的精子注射到水牛体外成熟卵内,观察水牛ICSI卵激活后的发育状态和外源基因的表达效果。结果表明:精子质膜完整性实验中,冻融破损精子质膜组早期胚胎基因表达率为21.8%,显著高于活精子组的5.1%(P<0.01);冻融组与活精子组的卵裂率、囊胚发育率均无显著差异(P>0.05)。以冻融、Triton×-100、超声波3种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率(16.7%)最高,显著高于Triton×-100组(P<0.01)。同时,冻融组的早期胚胎基因表达率亦显著高于Triton×-100组和超声断尾组(60.3%vs.31.7%vs.18.2%,P<0.01)。上述结果说明,使用ICSI技术转外源基因可获得表达EGFP基因的水牛早期胚胎;冻融精子质膜破损法能有效破损精子质膜,有利于外源DNA与精子的结合,且提高转基因效率。