广西巴马小型猪克隆胚的构建及胚胎移植

通过胚胎移植验证构建的广西巴马小型猪克隆胚是否可以发育到期。利用刺入式手术胚胎移植法,将0.5～1.5日龄巴马小型猪克隆胚移植到2头巴马小型猪和2头陆川猪的输卵管壶腹部。其中2头巴马小型猪和1头陆川猪返情,另外一头陆川猪于2007年10月13日产下1头克隆雄性巴马小型猪。说明巴马小型猪克隆胚能够在受体猪体内发育到期并产仔。

水牛瘤胃宏基因组的一个新的β-葡萄糖苷酶基因umcel3G的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶。本工作分6次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库,获得1.26×10~5个克隆,文库含外源DNA的总长度约为4.8×10~6 kb。从文库中筛选到118个表达β-葡萄糖苷酶活性的独立克隆。发现其中8个克隆表达的β-葡萄糖苷酶在pH5.0、37℃条件下活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆,序列分析发现一个2223 bp的潜在的编码β-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF),其编码产物的氨基酸序列与来自于Bacillus sp.的一个β-葡萄糖苷酶同源性最高,具有60%的一致性和73%的相似性。该ORF在E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似,酶谱分析表明该表达产物具有β-葡萄糖苷酶活性,证实该基因为一个β-葡萄糖苷酶基因。测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G的酶学特性,其最适pH和最适温度分别为6.0～6.5和45℃。一些金属离子如Ca^(2+)、Zn^(2+)能显著提高该酶的酶活,而另外一些金属离子如Fe^(3+)、Cu^(2+)能抑制Umcel3G的活性。在pH4.5、35℃和5 mmol/L的Ca^(2+)存在的条件下,用Ni-NTA纯化的重组酶的比活为22.8 IU/mg,说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值。

猪胎儿肾脏成纤维细胞体外培养体系的建立

本研究旨在建立猪胎儿肾脏成纤维细胞体外培养体系,并探讨其作为猪体细胞克隆供体的可能性。使用组织块培养法从体长为10cm以上的猪胎儿分离得到猪胎儿肾脏成纤维细胞,绘制了生长曲线,鉴定了细胞类型并且进行了细胞周期同期化效果的研究。结果表明:该培养体系可以支持猪胎儿肾脏成纤维细胞的体外生长,单个细胞均为梭形细胞,抗波形蛋白免疫荧光染色显示为阳性,而抗角形蛋白免疫荧光染色为阴性,分离到的细胞为胎儿肾脏成纤维细胞。使用血清饥饿法和接触抑制法诱导细胞进入G0/G1期,并且分别比较两者同期化效率,结果显示:血清饥饿2d和4d的同期化效率差异不显著,但都比8d组的高(88.97%和87.69%比82.45%,P<0.05);接触抑制4d、6d组间同期化效率差异不显著,但都比0d组的高(85.56%和85.89%比81.82%,P<0.05)。本研究在国内首次分离得到猪胎儿肾脏成纤维细胞,已经在体外传代培养到32代,其同期化效果好,可以作为体细胞克隆供体。

改良水稻对稻褐飞虱的抗性研究

稻褐飞虱是危害水稻的主要虫害之一,近年来在我国南方稻作区大发生,对我国的粮食安全构成了严重威胁。选育和利用抗虫品种是控制稻褐飞虱为害的最经济、有效的方法之一。对来源于普通野生稻的5个抗稻褐飞虱(BPH)基因进行了分子标记开发,通过杂交、回交和分子标记辅助选择转育和聚合BPH抗性基因到杂交水稻亲本中,获得了与抗BPH基因bph25(t),bph26(t),bph22(t),bph23(t),Bph24(t)紧密或较紧密连锁的SSR分子标记,这些标记的选择正确率达到60%～90%。成功地转育和聚合3～5个BPH抗性基因到5个杂交水稻亲本获得抗性基因聚合系。对其中9个抗性基因聚合系进行遗传背景分析和性状调查表明,遗传背景回复率已达90%以上,苗期和成株期(即全生育期)表现对BPH高抗性,主要经济性状与受体亲本(轮回亲本)基本没有差异。这些抗性基因聚合系在抗BPH水稻品种培育中具有重要的利用价值。研究结果为最终培育出一系列对BPH具有高抗性和持久抗性的水稻品种提供了物质基础和技术支持。

不同甘油浓度与平衡时间对食蟹猴精液冷冻效果的影响

探讨了不同甘油浓度（3%、5%、7%、11%）和不同平衡时间（30、60、90、120min）对食蟹猴（Macaca fascicularis）精液冷冻效果的影响,以建立和优化食蟹猴精液冷冻的程序。参照TTE稀释液成分组成改良型TTE,冷冻前和解冻后均检测精子的活力、畸形率、质膜完整性、顶体完整率。结果显示,平衡时间为30min时精子的冷冻解冻后活力、复苏率均高于平衡时间90min和120min组,差异显著（P〈0.05）,比60min组稍好;甘油浓度为3%、5%组的精子冷冻解冻后活力及复苏率均高于甘油浓度11%组,差异显著（P〈0.05）,比7%组好;不同甘油浓度各组间以及不同平衡时间各组间畸形率、质膜完整性、顶体完整率差异不显著（P〈0.05）。由此得出如下结论,在食蟹猴精液冷冻中,在改良TTE中加入3%-5%的甘油且平衡30min可以获得较好效果,精子冻后活率和复苏率达到45%和62%。

抗寒苹果“新冠”的茎尖组织培养

以苹果"新冠"茎尖为材料,通过研究不同的激素配比对芽增殖和生根的影响,探索抗寒苹果"新冠"的最适增殖培养基和生根培养基。结果表明:"新冠"的最适诱导培养基为MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA;最适增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05或0.08 mg/LNAA,其增殖系数达到7.4;最适生根培养基为1/2MS+0.2 mg/L IBA+0.6 mg/L IAA,其生根率达到90.5%。

猪卵母细胞蛋白质组双向电泳体系的建立及初步分析

建立了猪(Sus scrofa)卵母细胞蛋白质双向电泳平台,并对裂解液的组成、样品处理、双向电泳程序等相关技术进行优化,得到清晰的微量卵母细胞蛋白质的电泳图谱。利用上述优化后的体系分别对未成熟和成熟的猪卵母细胞进行双向电泳分析,并用ImageMaser软件对图谱进行比对分析。结果表明,电泳图谱上大约有800个左右的蛋白点,其中差异蛋白35个,包括上调蛋白22个及下调蛋白13个。说明基于双向电泳的蛋白质组学可以用于卵母细胞成熟的蛋白表达差异的研究。

猪单个卵母细胞体外转录体系的建立

利用switching mechanism at 5′end of RNA transcript(SMART)技术对猪单个体外成熟培养的MⅡ期卵母细胞进行了扩增,在此基础上,利用T7体外转录技术进行体外转录,aRNA浓度达到1.962μg。通过联合SMART技术和T7体外转录技术,mRNA浓度扩增了2.3×104倍左右,这个数量级已基本能满足cDNA array等通量筛选研究的需求。本研究为珍贵和微量的生物材料进行高通量筛选研究提供了一个有效的体系。

堆肥未培养细菌的宏基因组文库构建及新的木聚糖酶基因的克隆和鉴定

从自制堆肥样品中提取未培养细菌的总DNA,用柯斯质粒pW EB∷TNC为载体构建宏基因组文库,对文库进行筛选获得表达木聚糖酶活性的克隆,再进行亚克隆、测序分析以及B lastx搜索G enB ank分析木聚糖酶基因。结果构建得到一个包含约5万个克隆的宏基因组文库,文库中外源DNA总容量约为1.8×106kb,获得2个表达木聚糖酶活性的克隆:pGXN 1050和pGXN 1051,鉴定分析表明:pGXN 1050上潜在的木聚糖酶基因um xyn 11A具1个771bp的ORF(Open R ead ing F ram e),可编码含257个氨基酸的蛋白质,所编码产物与混合纤维弧菌(C ellv ibr io m ix tus)的内切-1,4-β-木聚糖酶(G enB ank索引号Z48925.1)的氨基酸序列有46%的一致性和57%的相似性;pGXN 1051上潜在的木聚糖酶基因um xyn 11B具一个723bp的ORF,可编码含241个氨基酸的蛋白质,编码产物与混合纤维弧菌的内切-1,4-β-木聚糖酶(G enB ank索引号Z48925.1)的氨基酸序列有73%的一致性和80%的相似性。木聚糖酶Um xyn11A和Um xyn11B都属于糖基水解酶家族11的成员。

胰岛素和胚胎培养密度对猪孤雌胚早期体外发育的影响

为了探讨胰岛素和胚胎培养密度对猪孤雌胚早期体外发育的影响,进一步优化猪早期胚胎培养体系,分别进行了胚胎培养液（NCSU-23）中添加不同批号和浓度的胰岛素以及不同胚胎培养密度（培养滴体积）对猪孤雌胚早期胚胎体外发育的影响试验,并于第2、7天分别统计胚胎分裂率和囊胚发育率。结果表明：①在NCSU-23中添加5.0μg/mL批号为I-1882（Sigma公司）的胰岛素,其囊胚发育率最高,为（33.48±12.79）%;②在体外培养25枚猪孤雌胚时,按胚胎数（枚）l培养液体积（μl）为1∶2.0~1∶3.0的比例进行培养,其培养效果较好。

小鼠性腺特异表达基因(GSE)的克隆及初步研究

从小鼠的睾丸中克隆了GSE(gonad-specific expression gene)基因,并对该基因进行序列分析和Southern、Northern杂交分析。核苷酸序列分析表明,GSE基因的ORF长度为745 bp,编码247个氨基酸,预测蛋白质分子量为27.6 kDa;Southern杂交证明GSE可能是单拷贝的基因;Northern杂交显示,GSE基因在小鼠体细胞组织(心脏、肝脏、肾脏、大脑、骨骼肌和脾脏)中没有检测到其表达,在睾丸中表达量很高,在卵巢中表达量较低。从推断出的氨基酸序列表明,GSE蛋白在细胞中可能是一个不带有信号肽的可溶性蛋白。

2005年玉林市冬种马铃薯病毒病调查

我区马铃薯种植近年来实现了跨越式的发展,2005年全区冬种马铃薯种植面积达10.2万hm2。2006年春,对兴业县、容县和玉林市福绵管理区的冬种马铃薯进行了病害调查,发现普遍存在疑似病毒症状的病株,病株率从5%到70%不等。用病毒特异的RT-PCR方法检测了田间采集的31个各类疑似病毒病样本,其中30个样本检出病毒,分别是马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯S病毒(PVS),马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯X病毒(PVX)。复合感染现象普遍,其中PVY和PLRV)复合感染最多,有3个样本同时受3种病毒感染。

放射形土壤杆菌突变株发酵条件及其可溶性胞外多糖结构的研究

目的:提高放射形土壤杆菌X1166101突变株发酵生产可溶性胞外多糖的产量,并探明所产多糖的化学结构。方法:采用单因素分析的方法对X1166101株的发酵产多糖条件进行了优化,采用色谱分析与波谱分析相结合的方法对多糖的结构进行了初步研究。结果:放射形土壤杆菌X1166101株产糖的最佳发酵条件为温度30℃、pH7.0、转速200r/min、装液量100mL(500mL摇瓶)、接种量8%,多糖产量达24.2g/L。该多糖是由葡萄糖单体以β-1,6糖苷键连接而成的带有丙酮酸分枝的高聚物。结论:放射形土壤杆菌X1166101突变株所产多糖极有可能是一种新型的细菌胞外多糖,具有较好的研发价值。

纸层析法测定缬氨酸含量的改良

改进了缬氨酸含量的测定方法。探讨了茚三酮与缬氨酸完全反应的质量分数范围;将传统的静置洗脱更改为匀速摇床洗脱,使洗脱更完全;在此基础上,详细研究了操作过程中的相关参数,使结果更精确。结果表明,该方法有很高的准确度和精密度,操作简便,成本低,可以广泛应用于茚三酮反应测定氨基酸。