广西陆川猪肺炎支原体P46基因克隆及序列分析

为了解广西陆川猪肺炎支原体（Mhp）地方流行毒株的主要免疫原性表面蛋白基因P46的序列特征、基本结构及遗传变异等特点，试验以2011至2013年广西纯种陆川猪疑似猪支原体肺炎（MPS）阳性病料为研究对象，抽提DNA进行PCR扩增，将克隆出与目的基因大小相符的片段回收，再与载体连接，转化到大肠杆菌DH5“感受态细胞中，筛选阳性克隆及测序，扩增获得4株Mhp毒株（GXLC1、GXLC2、GXLC3和GXLC4），随后用DNAStar软件对P46基因序列进行比对分析。结果表明，已克隆出的P46基因序列长度为1104bp，编码368个氨基酸，其中该序列中含有3个编码色氨酸的TGA密码子，而不是终止密码子；1个CGG为编码精氨酸的稀有密码子，而不是其他支原体中的无义密码子。所获得的4株Mhp毒株的P46基因序列与所参考的MhpJ株、232株、7448株及168株的核苷酸同源性为98．4％～99．4％，氨基酸同源性为98．6％～99．5％，毒株之间P46基因的同源性很高，保守性较强。

广西羊源布鲁氏菌的种型鉴定

为了对广西山羊体内分离的布鲁氏菌进行种型鉴定,选取广西隆安县和南宁市流产的山羊胎儿体内分离出的布鲁氏菌各1株,经16SrRNA基因序列扩增和测序发现,分离株与布鲁氏菌的同源性高达98.6%~100%,表明分离菌株为布鲁氏菌。采用MOS-PCR和生物学分型方法对分离株进行进一步鉴定,结果表明分离株均为羊种生物Ⅱ型布鲁氏菌。动物攻毒试验显示,分离菌株均为强毒菌株。药物敏感试验结果显示,强力霉素、四环素、庆大霉素、链霉素和卡那霉素有较强的抑菌效果。

一例多种病毒混合感染引起母猪繁殖障碍的实验室诊断

2014年4月初，广西某猪场送检流产母猪病料，畜主描述1周内猪场多头母猪流产，使用多种药物治疗无效。为能明确病因，根据发病情况、剖检病变，采集剖检流产母猪肺脏、淋巴结、脾脏等病料于广西兽医研究所病毒室进行实验室检测，结果确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）和圆环病毒2型（PCV2）多病毒混合感染导致的母猪流产。

广西鸡巨型艾美尔球虫的分离鉴定

为了了解广西鸡球虫病的流行种类,对一起疑似鸡巨型艾美耳球虫病例进行了临床诊断和实验室检测,并对分离到的球虫卵囊进行鉴定,从病例的病理变化和球虫卵囊形态特征等鉴定为鸡巨型艾美耳球虫。

禽流感病毒RT-LAMP检测技术的建立

根据GenBank中禽流感病毒(AIV)M基因序列,设计针对所有亚型AIV的通用检测引物,并对反应条件进行优化,建立了检测AIV的逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)可视化检测方法。结果表明,建立的检测方法对禽流感病毒总RNA最小检出限为10fg,灵敏度为RT-PCR的1 000倍,能特异地检测出所有不同的HA亚型禽流感病毒,对其他禽呼吸道病原体无扩增反应;本方法快速,在常规水浴锅或金属恒温槽中50min就可完成,反应结束后不需开盖即可直接用肉眼根据反应液的颜色变化对结果进行判定。本研究建立的禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法具有操作简便、仪器设备要求简单、灵敏、快速、特异等优点,适合在基层进行AIV的快速早期筛检。

白鹭源新城疫病毒的分离与鉴定

从1只患病的白鹭的咽喉、泄殖腔棉拭子中分离到1株病毒,经血凝、血凝抑制试验和RT-PCR法鉴定为新城疫病毒。根据该毒株对鸡胚平均致死时间、鸡胚半数致死量、鸡胚半数感染量的测定和新城疫强弱毒鉴别的RT-PCR检测,表明该分离株为新城疫强毒株。

猪链球菌2型对氟喹诺酮类抗菌药耐药机制的初步研究

为研究猪链球菌2型(S.suis 2)对氟喹诺酮类药物的耐药机制,本研究采用PCR和基因测序的方法分析氟喹诺酮类药物耐药诱导菌株的gyrA和parC喹诺酮耐药决定区(QRDR)。与亲本药物敏感菌株和自然耐药菌株相应的氨基酸序列对比,所有耐药诱导菌株GyrA QRDR均无特征性的氨基酸变异;而有62.5%耐药诱导菌株(5/8)的ParC QRDR在第83位氨基酸突变为赖氨酸。应用质子能驱动型外排泵抑制剂氰氯苯腙(CCCP)与氟喹诺酮类药物联合用药后,CCCP可以使耐药诱导菌株对药物的敏感性提高8倍～32倍。交叉耐药性结果显示,耐药诱导菌株获得了氟喹诺酮类药物交叉耐药。

新城疫病毒和鸭瘟病毒二重PCR检测方法的建立及初步应用

根据基因库中新城疫病毒(Newcastle diseases virus,NDV)和鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)的基因序列,分别设计了2对针对NDV和DPV保守基因序列的引物。用这2对引物对同一样品中的NDV和DPV模板进行二重PCR扩增,结果同时得到了2条特异性的、大小与试验设计相符的419(NDV)和602bp(DPV)的扩增条带,而对其他禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该二重PCR技术能同时检出0.4pg的NDV模板和126pg的DPV模板。

禽Ⅰ群腺病毒血清1型株灭活疫苗的研制

优化病毒的增殖条件,获得108.14 TCID50/mL,病毒粒子数为108.74 copies/mL的FAV-1抗原液,制备禽I群腺病毒血清1型(FAV-1)油乳剂灭活苗。比较甲醛及β-丙内酯的灭活效果,并进行疫苗成分最佳配比的优化,最后确认HLB 7.0,乳化剂含量10%,油水比为4∶1的比例稳定性最好、免疫效果最佳。疫苗免疫抗体水平的监测结果表明接种后第4周抗体水平达到最高峰,并在接种后第8周时仍具有较高抗体水平。攻毒试验结果显示,该疫苗对免疫组的保护率为100%,能完全抵抗病毒攻击。田间试验表明该疫苗达到预期免疫抗体水平,在接种后4个月保持高效价,到6个月时保持中等水平。本研究所研制疫苗免疫效果好,保存期长,安全性高。

鸡滑液支原体LAMP快速可视化检测方法的建立

为建立能够快速检测鸡滑液支原体(MS)的检测方法,本研究根据GenBank中MS热休克ATP依赖蛋白酶基因的保守序列,设计了一套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了MS的LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达102拷贝DNA,高于常规PCR方法 10倍;全部反应可以在1 h内完成;可以通过肉眼观察钙黄绿素颜色变化直接判定结果;对其它常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可以用于MS感染的快速检测。

肠炎沙门菌fliC蛋白的表达及ELISA检测方法的建立

为了给临床检测肠炎沙门菌提供一种切实可行的血清学方法,本研究根据肠炎沙门菌(SE)鞭毛蛋白基因(fliC)序列设计一对引物,利用PCR扩增出fliC基因大小为285bp,克隆到表达载体pGEX-4T-1中,成功构建重组质粒pGEX-4T-fliC。将重组质粒pGEX-fliC转化大肠埃希菌DH5诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,表达的水溶性重组蛋白大小为37ku,有较好的反应原性。以重组蛋白GST-fliC为包被抗原建立间接ELISA检测肠炎沙门菌抗体的方法,为肠炎沙门菌的检测提供一种敏感度高、特异性强的检测方法。

鸭圆环病毒LAMP可视化检测方法的建立

根据GenBank中DuCV基因序列,在保守区设计了6条特异性引物,并对反应条件进行优化,建立了一种适用于鸭圆环病毒(DuCV)的环介导等温扩增快速检测方法(LAMP)。该方法对H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎、鸭副黏病毒均无扩增反应;且扩增反应只需在常规水浴锅中进行,1小时内即可完成反应;对DuCV模版DNA的最小检测限为10fg,灵敏度是一步法PCR的1000倍。本研究建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行DuCV的快速检测。

Ⅰ群禽腺病毒五邻体蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种简便、快速检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVI)抗体的间接ELISA方法,以表达和纯化的FAVI五邻体重组蛋白作为抗原,优化反应条件,建立了FAVI间接penton-ELISA抗体检测的方法。抗原最佳包被浓度为1.5μg/孔,最适包被条件为37℃,2h后4℃过夜;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000;ELISA阴、阳性临界值为0.335。用penton-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为41%。

鸡柔嫩艾美耳球虫的分离及PCR鉴定

为了了解广西鸡球虫病的流行种类，确诊两起疑似鸡球虫病例感染球虫的种类，试验采用临床症状观察、剖检病理观察、实验室检查、PCR鉴定、动物回归试验等方法对鸡球虫病的流行种类进行了研究。结果表明：该两起病例有精神沉郁、排血便，盲肠异常肿大、充血等柔嫩艾美耳球虫病的典型症状和病变；实验室检查分离到了球虫卵囊，大小为（21．36-26．00）μm×（17．68—23．05）μm，形状指数为1．166；PCR扩增出清晰的目的条带；动物回归试验复制出临床相似病变。说明该两起鸡球虫病例感染的球虫种类为柔嫩艾美耳球虫。

H1亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种检测H1亚型禽流感病毒(AIV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据对GenBank中H1亚型AIV HA基因序列的分析,设计针对H1亚型AIV的HA基因特异性引物,并以H1亚型AIV的cDNA为模版,构建重组阳性质粒。采用梯度稀释重组标准品阳性质粒DNA的方法,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(real-time PCR)标准曲线。敏感性试验结果显示,扩增效率和标准误差分别为100.9%和0.011 7,熔解曲线呈单一熔解峰。在35个Ct值内该方法可检测到100个拷贝的标准品DNA;特异性试验结果显示,该方法对于其他亚型AIV和禽呼吸道病原体不能检出;重复性试验结果显示,组内变异系数小于1%。建立的Real-time PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于临床上H1亚型AIV的检测。

牛轮状病毒三种核酸检测方法的比较

利用针对牛轮状病毒(BRV)的普通PCR、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和环介导等温扩增技术(LAMP)三种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和417份临床疑似样品进行检测,比较三种核酸检测方法的检出结果。三种核酸检测方法中LAMP最敏感敏感,能检测到1拷贝/μL,Real-time PCR能检测到100拷贝/μL,普通PCR只能检测到1×104拷贝/μL。但结合临床样品检测表明:常规PCR方法敏感度低会造成一部分漏检,LAMP灵敏度高又会造成错检。综合比较三种方法后,推荐用LAMP结合real-time PCR,不仅节约成本,且结果更为准确可靠,可提高牛轮状病毒的检出率。

鸭瘟病毒LAMP可视化检测方法的建立

目的:建立一种快速、简便、特异性高的鸭瘟病毒(DPV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法。方法:根据Gen Bank中DPVUI6基因的保守序列设计一套特异性引物,并对反应条件进行优化,建立DPV的LAMP可视化检测方法。结果:建立的LAMP方法对其他鸭常见病原体无扩增反应;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;敏感性可达0.1fg,是常规PCR方法的100倍;扩增反应只须在常规水浴锅中进行,可在1 h内完成。结论:建立的DPV LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于DPV感染的快速检测。

鸭圆环病毒与鸭Ⅰ型肝炎病毒二重PCR检测方法的建立

目的:建立一种同时检测鸭圆环病毒(DuCV)和鸭Ⅰ型肝炎病毒(DHV)病原体的二重PCR技术。方法:根据DuCV和DHV的基因文库,分别设计了2对与DuCV和DHV某段基因序列互补的引物,用这2对引物对同一样品中DuCV和DHV模板进行二重PCR扩增。结果与结论:用建立的方法均同时得到了2条特异性的大小与实验设计相符(DuCV:245 bp;DHV:569 bp)的二重PCR扩增带,而且对其他禽病病原的PCR扩增结果均为阴性,能同时检出56pg的DHV RNA模板和6 pg的DuCV DNA模板。

猪繁殖障碍性疾病的主要发生原因与防治对策

猪繁殖障碍性疾病是指繁殖期内公、母猪由于疾病因素引起的，以妊娠母猪流产，产死胎、木乃伊胎、弱仔、畸形仔，少仔和公母猪不育症为主要特征的繁殖异常的一类疾病总称[1]。猪群中发生此病常常是两种以上的病原体共同作用或继发感染造成的，增加疾病诊断与防控的难度，进而引起猪只的高感染率和高死亡率，造成巨大的经济损失[2]。近年来，猪的繁殖障碍性疾病问题十分突出，给养猪业造成的经济损失很大，严重影响养猪业的健康发展。

H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立快速、准确检测H3亚型禽流感病毒（AIV）的方法,根据GenBank中H3亚型AIV HA基因序列,设计出1对特异性引物,通过优化反应条件建立了H3亚型AIV二温式RT-PCR检测方法。对该法进行特异性、敏感性检测,并对256份临床样品进行检测。结果表明,该法只能扩增H3亚型AIV,对其他亚型AIV及常见禽病病原体不扩增;对H3亚型AIV检测下限为1×10-4拷贝/μL;256份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。与普通RT-PCR相比该法节省了30min,表明所建立的H3亚型AIV二温式RT-PCR方法是一种快速、简便和特异的检测方法。