广西H9亚型禽流感病毒的分离鉴定和生物学特性研究

通过对2011年—2014年从广西不同地区的活禽市场、养鸡场、野生鸟类保护区等地采集的咽喉腔及泄殖腔拭子进行病毒分离,用血凝及血凝抑制试验初步鉴定出含H9亚型禽流感病毒的样品,对其进行纯化得到17株H9亚型禽流感病毒,用针对H9亚型禽流感病毒HA基因、N2亚型禽流感病毒NA基因的特异性引物对分离株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段后进行测序分析,结果显示所有分离株经鉴定均为H9N2亚型禽流感病毒。对所有分离株的生物学特性进行研究,发现17株H9亚型禽流感病毒分离株均符合低致病禽流感病毒的特点,其中16株分离株通过受体亲和特性测定证明具有SAα2,3及SAα2,6两种受体结合特性,提示具有感染哺乳动物的潜能。

鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一次性可同时扩增鉴别鸡新城疫病毒(NDV)和禽肺炎病毒(APV)的二重RT-PCR,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持。【方法】根据Gen Bank已发表NDV的F基因序列(Gen Bank登录号JX840454)和APV的F基因序列(Gene Bank登录号AF187154)分别设计2对特异性引物,应用这2对引物建立可同时检测鉴别NDV和APV的二重RT-PCR,对扩增条件进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验和临床样品检测等验证其实用性。【结果】优化后的二重RT-PCR可特异性扩增出参试NDV毒株(La Sota株、F48E9株、I株)及APV/MN-10毒株的目的条带,其大小分别为247和424 bp,而其他对照参试毒株在247和424 bp处均无特异条带出现。二重RT-PCR针对NDV和APV的最低检出限均为10 pg的RNA。应用建立的二重RT-PCR对132份从广西采集的病鸡样品进行检测,结果得到NDV阳性样品26份、APV阳性样品2份,与血清学方法的鉴定结果一致。随机选取的2份NDV阳性PCR产物与NDV(Gen Bank登录号JX840454)的F基因序列一致,同源性达100%;2份APV阳性PCR产物与APV(Gen Bank登录号AF187154)的F基因序列也完全一致,同源性达100%。【结论】针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点,可用于临床快速鉴别诊断,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技术支持。

铜绿假单胞菌生物膜研究进展

条件致病菌铜绿假单胞菌(PA)是一种能形成生物膜的革兰氏阴性菌,作者综述了PA生物膜形成的生物学机制,包括菌体黏附、胞外多糖Psl和Pel、藻朊酸盐等参与细菌生物膜成熟的过程及群体感应系统调节相关因子表达,从而调控细菌形成生物膜应对不良环境。此外还概括了将生物膜作为靶点开发的药物等生物膜相关的研究进展。生物膜是菌体逃避有害刺激的护盾,研究其结构、形成及致病机理,了解PA产生耐药性的分子机制,对于通过调节生物膜形成或调控生物膜相关因子的表达进而优化PA的抗感染治疗有十分重要的意义。

新生仔猪大批死亡疫情诊断及HP-PRRSV的分离鉴定

本试验通过对高发病率、高死亡率的新生仔猪腹泻病例进行诊断与控制,以期为该病的防控提供参考和借鉴。2013年1月初广西玉林某规模猪场发生以2-3日龄仔猪腹泻、呕吐、精神不振为主的疫情,发病率80%,死亡率80%-100%。为确定此次疫病的病因,本研究从发病猪群中采集10份病死猪小肠、脾脏、肺脏、淋巴结等组织进行细菌分离、PCR检测、病毒分离、病毒效价（TCID50）测定、基因测序与分析。检测结果显示猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）均为阳性,猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PRoV）均为阴性,未分离到致病菌。克隆测序分离株的ORF7和Nsp2全基因序列,结果显示分离株为美洲型PRRSV,ORF7基因全长为372bp,编码123个氨基酸;Nsp2基因全长为2 850bp,编码950个氨基酸,其中Nsp2基因在第481、532—560位发生了共30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV（HP-PRRSV）JXA1株Nsp2基因缺失特征一致,属于HP-PRRSV分离株。匀浆病料接种Marc-145细胞,48h开始出现PRRSV特征性病变,TCID50为10-5.75/0.1mL。推测此次新生仔猪大批死亡主要是PEDV感染后继发高致病性猪繁殖与呼吸综合征所致。

鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重RT-PCR检测方法的建立

本研究建立三重RT-PCR快速检测鉴别鸡新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(AIV)和禽肺炎病毒(APV)的方法。根据Gen Bank中H9亚型AIV HA基因和鸡NDV以及APV F基因的保守序列分别设计合成了三对特异性扩增引物,通过优化反应条件建立了三重RT-PCR检测鉴别鸡NDV、H9亚型AIV和APV的方法。对该方法进行特异性、敏感性和临床样品检测。特异性试验结果显示,所有参试的NDV、H9亚型AIV、APV分别扩增出大小为247 bp、569 bp和424 bp的片段,而对照的其他毒株不扩增;敏感性试验结果表明,本试验建立的方法能检测到10 pg的各自RNA模板。检测临床样品132份,NDV阳性26份,H9亚型AIV阳性6份,APV阳性2份,结果与病毒分离结果一致。PCR阳性产物测序结果与各自毒株序列100%同源。表明本试验建立的三重RT-PCR检测鉴别鸡NDV、H9亚型AIV和APV方法具有特异、敏感、快速的特点,可用于临床快速、准确的鉴别检测。

H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H9亚型禽流感病毒HA基因和禽肺病毒F基因的保守序列,通过Blast进行比对,在各自保守的基因序列中分别设计了两对特异性扩增引物,引物扩增的片段大小分别为569bp和424bp,应用这两对引物建立了H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒的二重RT-PCR检测方法,对建立的方法进行了特异性试验、敏感性试验和临床样品验证。对检测为阳性的样品进行克隆和序列分析,以验证本方法的准确性。特异性试验结果表明,所有参试的H9亚型禽流感病毒都能扩增出大小为569bp的片段,参试的禽肺病毒毒株扩增出424bp的片段,没有其他条带出现,而对照的参试毒株在569bp和424bp处没有任何条带;敏感性试验结果表明,本试验建立的方法能检测到10pg的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒RNA模板。应用本试验建立的方法对广西采集的病鸡样品132份进行检测,H9亚型禽流感病毒阳性的样品有6份,禽肺病毒阳性的样品2份;随机各挑取2份H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒阳性PCR产物进行克隆和序列分析,经比对分析,2份H9亚型禽流感病毒阳性PCR产物与H9亚型禽流感病毒(No.JF715045.1)100%同源,2份禽肺病毒阳性PCR产物与禽肺病毒株(No.AF187154)100%同源。本试验建立的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点,可以用于临床快速准确检测H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒。

禽呼肠病毒感染鸡胚成纤维细胞后Toll样受体mRNA转录水平的动态变化

为分析禽呼肠病毒(ARV)标准毒株S1133株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)后对相关鸡Toll样受体(ChTLRs)mRNA转录水平的影响作用,利用实时荧光定量PCR,测定和分析ARV-S1133感染CEF后ARV结构蛋白σC和ChTLRs的mRNA转录水平变化情况。结果表明,ARV-S1133感染CEF 10h后,ARVσC蛋白的mRNA相对表达量开始迅速上升,在48h达到峰值;同时,感染CEF中的ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21mRNA表达量发生显著变化,在感染72h内各个受体的mRNA表达量呈波浪式变化。5个不同滴度的ARV感染CEF 24 h后,ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21mRNA转录水平与病毒滴度均呈正线性相关。上述结果表明,ARV感染后可诱导CEF ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21的mRNA转录水平发生变化,可能与禽呼肠病毒的复制和致病机制相关。

禽呼肠孤病毒σA和σNS蛋白激活PI3K/Akt信号通路的研究

旨在探讨禽呼肠孤病毒(ARV)的σA和σNS蛋白是否是通过PXXP或YXXXM基序来激活PI3K/Akt信号通路的。作者采用重叠延伸PCR的方法,将σA和σNS基因的PXXP或YXXXM基序进行突变后构建了重组质粒,并在Vero细胞中进行了表达。通过流式细胞术和Western blot,检测转染后Vero细胞磷酸化Akt(P-Akt)的表达量,并与野生型σA和σNS蛋白激活的P-Akt表达量进行比较。结果显示,σA和σNS基因均得到了表达,σA基因的110—114和114—117位的PXXP基序突变后,Vero细胞P-Akt的表达量明显下降。可见,ARV的σA蛋白,是通过PXXP基序来激活PI3K/Akt信号通路的。本研究从细胞信号转导角度揭示了ARV与宿主相互作用的机制,也为寻找抗ARV药物作用靶标提供了新的思路。

2015年南宁市动物源性食品中金黄色葡萄球菌污染状况及耐药调查

目的调查2015年南宁市市售的动物源性食品中金黄色葡萄球菌的污染情况以及流行菌株的耐药情况,为食源性疾病监控提供数据支撑。方法随机采集市售的不同种类的动物源性食品383份,按照国标法进行金黄色葡萄球菌分离鉴定,并对分离到的28株金黄色葡萄球菌进行K-B纸片法耐药试验和PCR方法检测耐药基因。结果从383份动物源性食品中分离到28株金黄色葡萄球菌,耐药试验结果发现,其中10株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,28株分离株对不同的抗菌药物有不同程度的耐药,并检测到了4类耐药基因。结论市售动物源性食品中有金黄色葡萄球菌污染,存在引发食物中毒的风险;分离株的耐药试验结果可以为南宁市金黄色葡萄球菌引起的食物中毒提供用药参考。

猪源棒状杆菌的分离及其16S rRNA基因分析

本研究从某猪场发病保育猪的脓肿肺脏器官中分离到1株革兰阳性杆状菌,并进行形态特征、培养特性、生化特性、药敏试验、致病性试验及16S rRNA基因克隆与序列分析。结果显示,分离细菌在兔血琼脂平板和马血清胰蛋白胨大豆琼脂平板有氧条件下生长良好,可以致小鼠死亡,对头孢类抗生素和喹诺酮类抗菌药敏感;系统进化分析显示,分离菌株与棒状杆菌属细菌遗传进化关系较密切,其16S rRNA基因序列与棒状杆菌代表菌株的同源性在91.7%～98.3%之间,表明分离菌为棒状杆菌（Corynebacterium）。