广西区级动物标识及疫病可追溯体系建设

动物标识及疫病可追溯体系分为动物标识申购与发放管理系统、动物生命周期各环节全程监管系统、动物产品质量安全追溯系统三大部分。追溯体系的建立和完善,在广西动物防疫和检疫监督工作中发挥了重要作用,为畜牧业持续、快速、良性发展保驾护航。

水牛伊氏锥虫人工感染抗体规律及其广西地区自然感染状况的初步调查

通过实验感染,研究伊氏锥虫在水牛体内抗体及虫体消长的规律。ELISA检测结果表明,水牛感染伊氏锥虫后第6d检出抗体,而且在2个多月的监测时间里,抗体都维持在较高水平(OD450nm>0.3),因此可利用ELISA方法对水牛感染伊氏锥虫进行早期诊断和监测;水牛感染伊氏锥虫后,即出现一个2～3周左右的虫血症峰期,然后虫血症峰期迅速下降,在虫血症峰期下降后1个多月的监测时间里,虫血症维持在一个很低的水平(≤1条虫体/视野),水牛感染伊氏锥虫后这种峰期短无明显症状、虫血症水平低的现象,给临床诊断和血液镜检虫体造成了一定的困难。对广西部分地区79份血清样品水牛检测的结果表明,伊氏锥虫抗体阳性率达到29.1%,说明广西各地水牛感染伊氏锥虫的现象普遍存在,而且感染率比较高,为了保证本地区水牛产业的健康发展,有必要对水牛伊氏锥虫感染进行有效的监测。

不同动物来源的新城疫病毒F基因序列分析

为了解广西地区新城疫病毒（NDV）在不同动物宿主内的分布流行情况，对从广西地区鸡、野鸟、猪、鹅、马等5种不同动物体内分离到 NDV 毒株，进行了 F 基因的克隆扩增和序列分析。结果表明，5个NDV 分离株 F 基因的核苷酸序列同源性为85．2％～98．6％，推导氨基酸序列同源性为88．9％～98．6％，同源性差异较大；5个毒株的 F 基因与国内贵州、长春、福建等地的当前流行株同源性较高；以 F 基因前374 bp核甘酸同源性比较分型表明，鸡源、鹅源、马源毒株为当前流行的基因Ⅶ型，而猪源毒株和野鸟源毒株为传统的基因Ⅱ型。

广西山雉新城疫病毒分离株生物学特性测定

对1株从广西某山雉养殖场发病山雉中分离得到的新城疫病毒进行生物学特性测定。结果显示,分离株的鸡胚平均死亡时间(MDT)为50.4h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.58,F蛋白核苷酸序列与新城疫标准强毒株F48E9株的核苷酸同源性为84.5%,与Lasota的核苷酸同源性为81.8%,推导氨基酸在裂解位点的序列是112G-R-R-Q-K-R-F117。通过MDT、ICPI和推导氨基酸裂解位点分析,确定分离株是一株毒力较强的新城疫病毒强毒株。

广西地区2012~2014年仔猪腹泻流行病学调查与分析

本研究从2012~2014年收集广西地区猪群发生疑似仔猪腹泻的仔猪肠系膜淋巴结或肠样粪便样品,通过RT-PCR方法对收集到的1 600份样品进行猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪库布病毒（KobuV）检测和流行病学调查。结果显示：2012年TGEV、PEDV、KobuV流行率分别为1.2%、19.7%、38.2%,2013年分别为20.6%、85.7%、22.7%,2014年分别为0、4.1%、3.0%。不同时间有不同的主导病毒,提示我们兽医工作者应根据病原的变化,及时调整防控措施和对策。

来自5种动物禽Ⅰ型副粘病毒HN基因的序列分析

本研究对从广西5种不同动物体内分离到的禽Ⅰ型副粘病毒毒株,进行了HN基因的扩增、克隆和序列分析.5个APMV-Ⅰ分离株HN基因的核苷酸序列同源性为94.7％～98.4％,推导氨基酸序列同源性为96.3％～99％,同源性较高；5个毒株的HN基因与国内广东、山东、福建等地的当前流行株同源性较高,但与经典毒株同源性较低；遗传分析表明HN基因相对保守,都源于同一个基因亚群.

新城疫病毒和传染性支气管炎病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的快速鉴别检测方法,本研究根据NDV和IBV的基因保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的Taq Man探针;经过对反应条件的优化,建立了能够同时检测NDV和IBV的双重荧光定量RT-PCR方法。该方法对NDV和IBV的检测灵敏度均为10拷贝/μL,比常规RT-PCR敏感性高100倍;该方法对禽流感病毒、传染性喉气管病病毒、鸡白血病病毒、禽呼肠弧病毒检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性;批内和批间重复变异系数均小于2%。利用所建立的双重荧光定量RT-PCR方法及常规RT-PCR,对185份组织样品进行检测,符合率为100%。该方法可以用于NDV和IBV的快速定量检测。

广西猪源H9N2亚型流感病毒的分离与鉴定

用SPF鸡胚从广西地区猪群中分离到1株H9N2型猪流感病毒(SIV),经鸡胚接种3代后出现稳定的鸡血红细胞凝集效价为27,且凝集性能被H9亚型阳性血清抑制,而不被其他亚型流感病毒阳性血清所抑制。分离株的HA基因及NA基因扩增结果显示,该毒株HA基因与流感病毒H9亚型同源性最高,NA基因与流感病毒N2亚型同源性最高,说明该病毒属于H9N2亚型猪流感病毒,命名为A/Swine/Guan-gxi/01/2009。

鸡传染性支气管炎病毒广西株M基因的克隆与序列分析

参照GenBank中鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR扩增IBV广西株的M基因片段,将其克隆到pMD18-T载体中。序列分析结果表明,M基因全长为678bp,编码225个氨基酸,近N端含有2个潜在的N-糖基化位点,3个跨膜区位于23—98肽段区,亲水区较疏水区更易变异。IBV广西株与国内外IBV参考毒株相比,核苷酸序列同源性为83.6%-92.5%,氨基酸序列同源性为82.7%-95.1%。系统进化分析结果显示IBV广西株与SAIB20和LX4两参考株位于同一个分支上,它们的亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远。结果表明IBV广西株是1株新的IBV变异株。

鹅细小病毒广西株的分离鉴定

将广西某养鹅场5日龄发病的雏鹅肝脾处理后接种于10日龄的鹅胚,分离到一株病毒,对死胚收集的尿囊液进行荧光PCR确诊后,对其VP3基因进行扩增测序,通过与GDFSH株(Guangdong)、82-0308株(Taiwan)、HLJ01株(Heilongjiang)和HBZF07株(Hebei)VP3基因序列分析,核苷酸序列同源性在96.2%以上,从分子水平上鉴定该分离株是鹅细小病毒。

广西猪源Ⅰ型副粘病毒F基因测序分析

对广西猪源Ⅰ型副粘病毒F基因测序分析,为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考,也为有效防控副粘病毒感染奠定基础。参考GenBank发表的相关禽副粘病毒I型(Avian paramyxovirus serotype I,APMV-X)基因组序列,设计了1对特异性引物,用RT-PCR法分别扩增出病毒各F基因片段,并将目的基因片段回收纯化。测定得F基因的序列结果表明,从猪组织中分离获得1株猪源禽Ⅰ型副粘病毒,分离株F基因112～117位裂解位点的氨基酸组成为R-R-Q-R-R-F,与强毒株DQ417113、AF458012的裂解位点一致。同源性分析结果表明,分离株与标准强毒株的核苷酸同源性分别为87.5%和87.4%。猪源禽I型副粘病毒分离株为强毒株,属于基因Ⅰ型是传统型毒株,广西地区禽I型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势。

荧光定量RT-PCR检测鸡新城疫病毒方法的建立及应用

针对新城疫基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性的探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法,构建重组质粒作为阳性标准品,建立了检测NDV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如鸡传染性支气管炎(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克氏病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.9×101拷贝/!L的病毒核酸,与常规RT-PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于3%。结果表明,本研究所建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于新城疫的定量检测。

广西部分规模种猪场猪伪狂犬病病毒gE抗体调查

为了解广西部分种猪场猪伪狂犬病毒(PRV)的感染情况,2013年1月—2013年12月对18个不同规模种猪场送检的2 793份血清样品,采用法国LSI猪伪狂犬病毒gE基因抗体检测试剂盒进行检测,发现猪伪狂犬病gE抗体阳性138份,总阳性率为4.94%,其中四个猪场检出PRV野毒感染。研究表明,广西部分猪群中存在PRV感染,感染率不一,某些猪场感染率相对较高。

广西马源H9亚型流感病毒的血清学调查

为了解广西马源H9亚型流感病毒的感染情况,本研究从广西4个主要养马地区采集马血清样品共计1 110份,采用血凝抑制(HI)试验方法进行抗体检测。结果显示,1 110份血清样品中共检测出阳性血清7份,平均抗体阳性率为0.54%。本实验结果表明,广西马群已受到H9亚型流感病毒的感染。

O型口蹄疫病毒VP1基因主要抗原位点基因串连表达载体的构建及序列测定

以构建好的O型FMDV VP1基因的重组质粒PMD18-T—VP1为模板，通过PCR扩增出VP1基因主要抗原位点VP1（61～180bp）的核苷酸及VP1（421～639bp）的核苷酸，采用重组PCR方法将扩增所得的2个基因片段用linker连接，结果构建出1个含384bp的重组质粒，将该重组质粒定向插入原核表达载体pGEX-6P-1，成功构建了pGEX-6P-1-VP1（384bp）串联表达载体。该串联表达载体的构建为进一步研制FMDV的诊断抗原及多肽疫苗奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株VR2332保守序列与近年PRRSV自然变异株序列分析研究,设计合成了2对特异引物,分别扩增出225、427bp两条特异型基因片段,通过优化RT-PCR条件,建立了可同时检测PRRSV标准株和NSP2变异株的二重PCR诊断方法。应用该方法分别对广西不同地区的16份病、死猪的血液、肺等组织进行检测,结果15份PRRSV阳性,其中1份为标准株,14份为变异株。试验结果表明,PRRSV标准株与变异株二重PCR诊断方法具有高度特异性、敏感性和实用性,可用于临床诊断,为目前流行的猪高热病病原研究及广西PRRS的防制提供了一定科学依据。

致病性猪链球菌2型的病原分离鉴定及毒力因子的PCR检测

通过对广西某猪场急性死亡的猪进行病原分离,分离到革兰氏阳性球菌,用链球菌快速鉴定试剂条Rapid ID 32Strep鉴定为猪链球菌2型;并对分离菌进行猪链球菌2型荚膜多糖抗原(cps2J)及其重要毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外蛋白因子(EF)和溶血素(SLY)的多重PCR检测,同时对cps2J基因进行序列测定,与GenBank发表的猪链球菌2型相比,同源性为98.8%,毒力因子MRP、EF和SLY检测均为阳性,证实广西某猪场急性死亡的猪为高毒力猪链球菌2型感染所致。动物试验中,该菌可引起小白鼠部分死亡,家兔体温最高升至40.3℃,最后败血而死。