呼吸系统基础与疾病教学模块建设及优化

文章立足于新医科背景,在深入剖析广西医科大学临床医学教学改革班呼吸系统基础与疾病教学模块整合前后所遇主要问题及原因的基础上,系统阐述了呼吸系统基础与疾病教学团队在课程整合及优化中所采取的系列教学改革措施及课程建设取得的初步成效。

精子蛋白sp32/OY-TES-1 mRNA及其蛋白在正常组织表达的探讨

目的了解正常组织中sp32/OY-TES-1 mRNA的表达量是否存在差异以及该蛋白的表达情况,为sp32/OY-TES-1表达谱增加更多信息。方法提取40例(19种)正常组织总RNA,逆转录-聚合酶合成cDNA,普通PCR检测cDNA质量;构建目的基因sp32/OY-FES-1及看家基因HPRT质粒,制备标准品,绘制标准曲线,建立实时定量PCR(TaqMan)方法和优化反应体系,检测组织中sp32/OY-TES-1和HPRT的表达,sp32/OY-TES-1 mRNA的表达量以OY-TES-1/HPRT表示。通过制备的OY-TES-1多克隆抗体,结合免疫组织化学检测sp32/OY-TES-1蛋白在多种正常组织中的表达。结果正常组织中sp32/OY-TES-1 mRNA阳性率为72.50%(29/40);2.非睾丸正常组织中sp32/OY-TES-1 mRNA的相对表达量值(目的基因/看家基因)为0.0001～0.4950,呈对数正态分布;3.睾丸组织中sp32/OY-TES-1 mRNA的相对表达量为44.9,是其他正常组织的91～1000倍;4.免疫组织化学(IHC)显示在所检测的多种正常组织和细胞中(10例睾丸组织、8例结肠、7例肝、6例骨骼肌、5例胃、5例晶状体、4例精子、3例外周血白细胞和1例肾),除4例精子和1例肾组织中的肾小管外,其余均未见OY-TES-1蛋白阳性反应。结论sp32/OY-TES-1 mRNA广泛地表达在各种正常组织,表达量因组织不同而异;睾丸组织是所检测的正常组织中其mRNA表达量最高的组织。而sp32/OY-TES-1蛋白比其mRNA更具有限制性表达的特点。

GCF2选择性剪接区在肝癌组织及细胞株中的表达及意义

目的：研究肿瘤相关抗原GCF2选择性剪接区在人肝癌细胞株、肝癌组织、癌旁组织及正常成人肝细胞及组织中的表达及意义.方法：采用RT PCR检测GCF2 5个选择性剪接区（D1～D5）在人肝癌细胞株、43例肝癌组织、相对应的癌旁组织,以及正常成人肝细胞株及9例肝组织中的表达.结果：GCF2 4个选择性剪接区（D1～D4）在所检测的细胞株、肝癌组织、癌旁组织和正常成人肝组织中均未检测到表达;GCF2选择性剪接区D5仅在人肝癌细胞株检测到阳性表达;在43例肝癌组织及相应的癌旁组织中,有41例肝癌组织GCF2选择性剪接区D5呈阳性表达,阳性表达率为95.35％ （41/43）,而9例正常肝组织均未检测到GCF2选择性剪接区D5表达.结论：GCF2 D5选择性剪接区在肝癌组织中有较高阳性表达,GCF2选择性剪接区D5可能与肝癌的发生发展有关.

无精子症患者病理组织中Survivin与Caspase-3的相关性研究

目的探讨生存素(Survivin)与半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)在无精子症睾丸中的表达相关性。方法用免疫组织化学方法检测44例无精子症患者睾丸组织中的Survivin、Caspase-3。结果Survivin阳性(+～+++)表达率在生精功能正常组与生精功能异常组分别为100.0%(11/11)、63.6%(21/33),两者比较差异有统计学意义(P<0.05);Caspase-3阳性(+～+++)表达率在生精功能正常组与生精功能异常组中分别为18.2%(2/11)、39.4%(13/33),两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。Survivin与Caspase-3表达呈负相关(r=-0.636,P<0.05)。结论Survivin与Caspase-3的低表达可能共同参与了人睾丸精子生成过程。

微小组织结构石蜡切片的制备

微小组织结构是指在组织工程构建过程中获得,具有体积小、结构相对简单等特点的组织样结构;与从成体器官分离、临床病理穿刺活检等途径获取的组织显著不同,因此在制备微小组织结构石蜡切片时,存在诸多问题。本科室根据微小组织的结构特点,通过改良和优化经典石蜡包埋、切片制备方法,分析适合微小组织结构石蜡包埋切片的制作方案,最终完成厚度为5μm连续石蜡切片的制作,其蜡带完整,HE染色可见微小组织结构的细胞形态正常、着色效果好、色泽对比饱满、各层次结构完整,现报道如下。

七种癌-睾丸抗原基因在广西肝细胞癌中的表达

广西是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的高发区，其死亡率极高。尽管目前已建立了许多治疗的方法，但五年的生存率仍很低。因此急需寻求新的治疗方法，而免疫治疗正是其中新方法之一，但开展免疫治疗的前提是特异性肿瘤抗原的存在。目前己发现了众多的肿瘤相关抗原，其中一类为癌-睾丸抗原(Cancer-Testis Antigen，CTA)，

精子蛋白Sp32/OY-TES-1基因mRNA表达的探讨

目的了解精子蛋白Sp32/OY-TES-1基因mRNA的表达特点,研制癌-睾丸抗原(CTA)的肿瘤疫苗。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测95例正常人组织及125例人肿瘤组织中Sp32/OY-TES-1mRNA的表达,随机选取RT-PCR阳性产物12份进行DNA测序;对所得数据进行统计学分析。结果Sp32/OY-TES-1在正常和肿瘤组织中的表达频率分别为68.4%(65/95)和44.00%(55/125),两者比较有统计学意义(P<0.05)。在24种不同器官的正常组织中,21种表达Sp32/OY-TES-1基因mRNA(87.50%)。DNA测序结果证实,RT-PCR产物为Sp32/OY-TES-1基因。结论Sp32/OY-TES-1基因的mRNA在正常组织中广泛表达,它是否可归为睾丸和肿瘤限制性表达的基因尚需进一步研究。

肝细胞癌手术切除患者住院期间死亡的相关危险因素分析

目的探讨肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者肝切除术后住院期间死亡的相关危险因素,为临床提高手术安全性提供参考。方法回顾性分析1 403例HCC肝切除手术后住院期间死亡患者25例(死亡率1.7%)的临床资料,选取同期匹配年龄和切肝量获得对照患者75例,收集100患者的临床和病理资料,对肝切除术后住院期间死亡的相关危险因素进行统计分析。结果单因素分析影响患者预后的危险因素包括Child分级(Child B)、华支睾吸虫、手术时情况评估肝硬化(重)、BCLC分级(C)、门脉高压、手术时出血量、Child-Pugh分期相对切肝量。多因素分析影响患者术后住院期间死亡的独立危险因素包括手术出血量、肝硬化程度、门静脉高压症、术前肝功Child-Pugh评级(P<0.05)。结论降低肝切除术后住院期间死亡风险的关键是严格掌握适应证,选择适当手术时机,提高手术操作技巧减少术中出血以及术后全面的监测管理。

黑色素瘤相关抗原MAGE-E1 mRNA在胶质瘤中的定量表达研究

目的:了解MAGE-E1 mRNA在胶质瘤中的表达,探讨将它用于胶质瘤免疫治疗的可能性。方法:建立实时定量PCR方法,检测47例人胶质瘤及14例正常脑组织中MAGE-E1,管家基因HPRT1作为内参,以MAGE-E1/HPRT1值计算MAGE-E1 mRNA表达量,并对MAGE-E1 mRNA表达与临床指标的关系进行分析。结果:在正常脑组织及胶质瘤中,MAGEE1高度表达率分别为7.1%和66.0%,两者比较具有统计学差异(P<0.05)。MAGE-E1 mRNA的表达与病人性别、年龄、病理类型和级别无关。结论:MAGE-E1 mRNA在胶质瘤中水平较高,提示MAGE-E1可能成为胶质瘤免疫治疗的候选靶抗原。

GC结合因子2在肝细胞癌中的表达和意义

目的:探讨转录因子GC结合因子2(GC binding factor 2,GCF2)蛋白的表达与肝细胞癌的关系。方法:用免疫组化方法检测21例正常肝组织,58例肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)及其对应癌旁组织(n=58)中GCF2的表达情况。结果:GCF2在HCC组织中的阳性表达率(31.0%,18/58)显著低于癌旁(84.5%,49/58)和正常肝组织(90.5%,19/21)(P<0.05),GCF2在HCC组织中的表达量亦显著低于癌旁和正常肝组织(P<0.05);GCF2的阳性表达与HCC患者的性别、年龄、肿瘤大小、临床分期、有无肝硬化基础、AFP及HBsAg情况之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:GCF2在HCC中的表达下降与HCC的发生可能有一定关系。

EGCG对前列腺癌PC-3细胞生长增殖的影响

目的探讨表没食子儿茶素没食子酯酸(EGCG)对前列腺癌PC-3细胞细胞增殖和细胞周期的影响。方法MTT法检测EGCG对前列腺癌PC-3细胞生长和增殖的抑制作用;流式细胞仪DNA含量分析法探讨EGCG对前列腺癌PC-3细胞周期的影响。结果与对照组相比,3组不同浓度EGCG均能明显抑制前列腺癌PC-3细胞生长,G0～G1期细胞增加。结论EGCG可将前列腺癌PC-3细胞阻滞于G0～G1期,抑制细胞增殖。

癌-睾丸抗原SSX基因在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的:检测癌-睾丸抗原SSX1-5 mRNA在肝细胞癌(HCC)组织中的表达,探讨其用于HCC免疫治疗的可能性.方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测61例HCC组织及52例配对的HCC癌旁组织中SSX1-5 mRNA,结合临床相关指标进行统计学分析.随机抽取PCR阳性产物进行DNA测序.结果:SSX1、SSX2、SSX4和SSX5 mRNA在HCC中的表达率分别为42.6%(26/61)、8.2%(5/61)、39.3%(24/61)和6.6%(4/61);未检测到SSX3的表达.在癌旁组织中,未检测到SSX1-5 mRNA;HCC组织中,至少表达1个SSX基因者达50.8%(31/61);表达2个或2个以上者达32.8%(20/61),表达3个或3个以上者达9.8%(6/61),同时表达4个者达3.3%(2/61).SSX的表达与临床相关指标关系的分析结果显示:门静脉癌栓形成与SSX1的表达、患者的年龄与SSX4的表达均具有显著性差异(P<0.05);DNA测序证实PCR阳性产物为目的基因.结论:SSX1、SSX2、SSX4和SSX5在HCC组织中表达频率不尽相同,但具有较强的特异性,提示有可能成为HCC免疫治疗的靶抗原.

水蛭素对鼻咽癌CNE2细胞株作用机制的研究

目的:初步探讨水蛭素对鼻咽癌(NPC)CNE2细胞株的作用机制。方法:以NPC细胞CNE2为研究对象,采用MTT检测水蛭素对CNE2细胞株的增殖抑制率,应用流式细胞术检测凋亡及分析细胞周期的变化。结果:水蛭素对CNE2细胞有明显的增殖抑制作用,且抑制作用随水蛭素浓度和时间的增加而增强(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,水蛭素具有诱导CNE2细胞凋亡的作用,凋亡率随着水蛭素浓度的增加而增高(P<0.05);水蛭素使CNE2细胞周期阻滞于G2/M期。结论:水蛭素对鼻咽癌CNE2细胞增殖有明显的抑制作用,水蛭素作用机制可能是通过诱导癌细胞凋亡并阻滞细胞周期于G2/M来实现的。

肿瘤抑制基因ARHI的研究进展

ARHI是Ras超家族中第一个被报道的肿瘤抑制基因 ,定位于人染色体 1p31,属小GTP结合蛋白 ,与Ras拥有相似的GTP/GDP结构域 ,却具有抑癌作用。ARHI是母源性印迹、父源性表达 ,可参与细胞周期调控和信号通路转导 ,从而负向调节细胞生长。在正常人类多种组织中都存在ARHI基因的表达 ,但在肿瘤组织中其表达却下调。ARHI的表达异常可能与印迹基因的杂合性丢失 ,DNA甲基化和染色体乙酰化修饰等转录水平的调节失常有关。

骨髓源性间充质干细胞三维微环境复合培养体系的构建

目的:构建三维微环境复合体培养体系,探索骨髓源性间充质干细胞在支架内生长、分化的规律。方法:通过贴壁培养法建立稳定的骨髓源性间充质干细胞系,采用流式细胞仪检测细胞表面标志;将壳聚糖,β-甘油磷酸钠及羟乙基纤维素按比例混合制备温敏性水凝胶。选取第3代骨髓源性间充质干细胞接种支架培养2周后,加入心肌组织裂解液培养5d。倒置相差显微镜下连续观察细胞形态变化的特征,收集细胞支架复合物行苏木精—伊红染色,扫描电镜观察其超微结构。结果:骨髓源性间充质干细胞经流式细胞仪检测表达CD29,不表达CD34。温敏性水凝胶含交织成网格状的纤维样结构,网孔内含胶冻样物质。骨髓源性间充质干细胞接种后呈球形,折光性好,不仅分布于纤维样结构表面,还渗入网孔内生长;HE染色支架呈嗜酸性;扫描电镜下可见支架具有适宜的孔径,细胞在支架上分裂增殖活跃;添加心肌组织裂解液后,细胞逐渐拉长呈梭形。结论:在构建的三维微环境复合培养体系中,骨髓源性间充质干细胞与支架生物相容性良好;复合培养体系能较好的模拟体内微环境,促进骨髓源性间充质干细胞的增殖、分化。

OY-TES-1诱导的树突状细胞对T淋巴细胞的增殖活化作用

目的通过癌-睾丸抗原OY-TES-1致敏树突状细胞(DC),研究其对T淋巴细胞的增殖活化作用。方法体外诱导培养人外周血DC,观察其细胞形态并经流式细胞仪进行表型鉴定;分别用OY-TES-1融合蛋白(OY-MBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)致敏DC,与T淋巴细胞共同培养。CCK-8法检测不同蛋白致敏DC后T淋巴细胞的增殖,ELISA检测致敏DC与T淋巴细胞共同培养后上清液IFN-γ的含量。结果诱导出高表达HLA-DR、CD86、CD83和CD80并具有典型细胞特征的DC。经不同蛋白致敏的DC均能促进T淋巴细胞的增殖活化,其中OY-MBP致敏的DC促进T淋巴细胞增殖的能力明显强于其他各组(P<0.05),IFN-γ分泌量也明显高于其他各组(P<0.05)。结论 DC在体外经OY-TES-1融合蛋白致敏后,可显著促进T淋巴细胞的增殖活化。

缺氧诱导因子-2α通过血管生成素-2途径调控缺氧诱导血管形成的研究

目的 探讨缺氧诱导因子-2α（HIF-2α）调控缺氧环境下内皮细胞血管形成的机制.方法 采用实验研究方法.（1）细胞分组：取对数生长期人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）：细胞不做任何处理设为空白对照组,细胞转染对照shRNA设为空载体组,细胞转染HIF-2α shRNA设为HIF-2α沉默组,细胞转染HIF-2α shRNA后加入rh-Ang-2设为HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组.（2） Western blot检测：①缺氧环境下培养0、2、4、8、12、16、20 h的HUVECs中血管生成素-2（Ang-2）和HIF-2α的蛋白表达量.②检测空白对照组、空载体组和HIF-2α沉默组HUVECs中Ang-2和HIF-2α的蛋白表达量.（3）ELISA检测：检测空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组HUVECs上清液中Ang-2水平.（4）小管形成实验检测：空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组和HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组HUVECs中内皮细胞小管数目.（5）Transwell法检测细胞迁移：①空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组和HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组HUVECs迁移细胞数目.②空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组和HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组HUVECs上清液干预肝癌细胞SMMC-7721后,肝癌细胞SMMC-7721迁移数目.正态分布的计量资料以-x±s表示,重复测量数据采用重复测量的方差分析,多组间比较采用单因素方差分析并采用Dunnett＇s test进行组间两两比较.结果 （1） Western blot检测相关蛋白表达量：①HUVECs缺氧培养0、2、4、8、12、16、20 h细胞中Ang-2的表达量分别为0.110±0.011、0.120±0.020、0.210±0.070、0.410±0.100、0.520±0.090、0.790±0.130、1.010±0.220;HIF-2α的表达量分别为0.180±0.090、0.410 ±0.070、0.470±0.110、0.470±0.070、0.580 ±0.120、0.690 ±0.140、0.920±0.130,经缺氧处理后两种蛋白表达量均有增高,且随缺氧时间延长,表达量呈升高趋势,差异有统计学意义（F =403.550,3 265.587,P＜0.05）.②空白对照组、空载体组和HIF-2α沉默组HUVECs中Ang-2的蛋白表达量分别为1.030 ±0.180、1.070 ±0.120、0.210±0.070,HIF-2α分别为0.940±0.110、0.930 ±0.190、0.170±0.021,3组上述指标比较,差异均有统计学意义（F=290.242,26.688,P＜0.05）.（2）ELISA检测结果显示：空白对照组、空载体组和HIF-2α沉默组HUVECs中Ang-2表达量为（433.2±9.7）ng/L、（438.3±2.6）ng,/L、（114.6 ±4.2）ng/L,3组比较,差异有统计学意义（F=2 642.180,P ＜0.05）.（3）小管形成实验结果显示：空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组和HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组HUVECs中内皮细胞小管数目分别为（48.3±2.5）个、（47.4±3.1）个、（19.7±1.5）个、（38.3±2.1）个,4组比较,差异有统计学意义（F=148.196,P＜0.05）.（4） Transwell法检测细胞迁移结果：①空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组和HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组HUVECs中,迁移细胞数目分别为（140.3±3.5）个、（142.7±2.1）个、（42.7±3.1）个、（78.1±4.2）个,4组比较,差异有统计学意义（F=212.205,P＜0.05）.②Transwell法检测4种不同上清液干预的SMMC-7721细胞迁移结果：空白对照组、空载体组、HIF-2α沉默组和HIF-2α沉默联合rh-Ang-2组上清液分别处理SMMC-7721细胞后,其细胞迁移数目分别为：（106.7±5.5）个、（102.7±6.6）个、（63.0±3.3）个、（96.7±2.1）个,4种处理方式比较,差异有统计学意义（F =55.122,P＜0.05）.结论 HIF-2α可通过Ang-2调控缺氧下内皮细胞的血管形成,并通过内皮细胞分泌的Ang-2促进肝癌细胞SMMC-7721迁移.

脂质体转染survivin反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞凋亡的影响

目的探讨survivin反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)对人胰腺癌细胞PANC-1增殖的影响。方法设计并合成特异性靶向ASODN及正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,SODN)。ASODN经FAM标记,以阳离子脂质体为载体转染至体外培养的PANC-1细胞中(ASODN组),另设空白对照组(正常培养的细胞)、脂质体空转染组(脂质体转染的为正常的培养基)及SODN组作为对照组。采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测转染率,依次筛选最佳细胞接种数量、ASODN浓度和脂质体的量;荧光显微镜观察转染后的细胞;MTT法测定转染后细胞的抑制率;透射电镜观察转染后细胞的超微结构变化;吖叮橙(AO)与溴化乙啶(EB)染色观察转染后细胞凋亡的形态学改变;DNA凝胶电泳观察转染后细胞凋亡情况;FCM测转染后细胞凋亡率及细胞周期;免疫组织化学技术检测转染后survivin蛋白的表达。结果①ASODN浓度为50、100、150、200、250、400、600及800 nmol/L时,转染率分别为31.9%、37.4%、41.4%、52.6%、24.2%、11.4%、16.1%和15.5%;接种细胞数量为2×104、2×105及2×106个/孔时,转染率分别为12.0%、50.8%和11.2%;转染所用的脂质体量为2、3及4μl时,转染率分别为58.8%、34.0%和23.6%。②转染ASODN后荧光显微镜发现转染后细胞之间空隙加大,形态变圆,贴壁细胞生长较少,部分漂浮于培养液中。③ASODN组24、36及48 h后细胞抑制率明显高于各对照组(P<0.05),随着时间延长,细胞抑制率增高(P<0.05)。④ASODN组电泳图上凋亡细胞呈明显的"梯状"条带。⑤AO与EB染色观察ASODN组细胞出现凋亡的形态学改变,其核染色质均高度聚集或核染色呈新月形聚集于核膜一边,核仁消失。⑥ASODN组细胞凋亡率为(38.10±3.4)%,明显高于SODN组的(4.16±1.7)%(P<0.05)。⑦ASODN组细胞周期阻滞于G2/M期。⑧转染后ASODN组survivin蛋白表达明显低于各对照组(P<0.05)。结论 survivin ASODN转染至胰腺癌细胞最佳转染条件为接种细胞数量为2×105个/孔,ASODN的浓度为200 nmol/L,脂质体的量为2μl;survivin ASODN能明显下调survivin蛋白的表达,抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。