MPTP诱导的食蟹猴偏侧帕金森病模型运动行为学的长期动态评价研究

目的建立具有长期运动行为学改变的灵长类动物模型,用于研究神经保护性药物的研究。利用不同运动变化评估方法探讨1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的食蟹猴偏侧帕金森病(Parkinson's disease,PD)模型运动行为学的长期动态变化。方法 5只(6~7岁)健康雄性食蟹猴分别于左侧颈内动脉注射MPTP建立偏侧PD模型。在MPTP注射前(基线),注射后3、6个月及1、3、6年分别进行临床评分;在MPTP注射前,注射后3、6个月及1年和6年分别进行24 h躯体自发运动总量行为监测。结果造模后3个月临床评分(14.65±8.41)增高到达高峰,造模6个月后临床评分(8.10±2.01)仍较基线高,但与3个月时比较显著降低(P=0.006);之后维持稳定,直至造模6年后临床评分与6个月时比较差异无统计学意义。而24 h躯体自发运动总量造模后3个月降低最明显(16 597.79±12 488.87),造模后6个月有所恢复(29 278.02±12 264.66),但与基线(50 084.20±30 170.89)比较仍显著性降低(与3、6个月比,P值分别为0.014,0.016);造模1年和6年后的24 h躯体自发运动总量恢复到基线水平。结论颈内动脉注射MPTP可以诱导形成稳定具有长期运动症状的偏侧PD模型,尤其是临床评分的改变,直到造模后6年仍存在异常。

帕金森病食蟹猴系统性模型构建与在体临床过程的动态评价研究

目的应用行为学与分子影像学的方法在体动态评价帕金森病食蟹猴系统性模型的临床变化特征,为药物、干细胞等治疗的临床前研究提供稳定有效的PD灵长类动物模型。方法 7只10～15岁的健康食蟹猴连续静脉注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)0.2 mg/kg体质量,诱导系统性PD模型,持续观察PD症状进展3个月,随后给予左旋多巴干预。应用PD评分量表评价动物的临床症状严重程度,用EthoVision动物运动轨迹跟踪系统分析随意运动距离、运动轨迹的变化,用正电子发射断层显像技术(Positron emission tomography,PET)分子显像剂^(18)F-AV-133评估纹状体多巴胺能神经元的功能状态。结果所有动物在给予MPTP注射14 d后出现了典型的包括震颤、肌僵直、运动迟缓等PD症状,1个月临床评分达到峰值(21.43±5.35)。随后PD症状趋于稳定,连续观察至2个月(18.43±3.87)、3个月(18.14±3.53),与MPTP注射结束时(14.43±1.90)相比,临床评分均显著升高(P<0.05)。在3个月随意运动距离(809.77±401.15)cm较基线(8627.46±5751.04)cm显著降低(P<0.01)。^(18)F-AV-133双侧纹状体平均特异性摄取率(Sur)在3个月时(0.16±0.03)较基线(1.66±0.58)显著降低(P<0.01)。在给予L-Dopa干预后可见PD症状显著改善,临床评分(12.86±3.63)较之模型期显著降低(P<0.05),而随意运动距离则显著增加(P<0.05)。结论本研究构建的PD食蟹猴系统性模型临床症状持续稳定,纹状体多巴胺能神经损害,对L-Dopa干预有效,全程无自发性恢复,更近似地在体动态模拟了PD的临床特征,以期为PD未来研究提供实验依据。

Garcinone E抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的研究

目的探讨源于岭南山竹的天然产物单体Garcinone E对鼻咽癌细胞增殖、迁移侵袭能力的影响及其分子机制。方法 MTS法检测鼻咽癌HONE1和HK1细胞的增殖率;Transwell细胞小室检测HONE1和HK1细胞迁移和侵袭的能力;Western blot和q-PCR法检测HONE1和HK1细胞上皮间充质转化(EMT)相关标志性蛋白和基因表达及可能的信号通路。结果 MTS 24 h结果显示Garcinone E可显著抑制鼻咽癌细胞HONE1和HK1的生长,并和浓度呈正相关作用。Transwell小室实验显示,与对照组相比,Garcinone E的给药浓度为7.5μmol/L时,HONE1和HK1细胞穿过小室的数量明显减少,其迁移和侵袭能力明显受到抑制。Western blot检测发现Garcinone E呈剂量依赖性地下调p-Vimentin、Snail及Slug蛋白的表达,同时增加E-cadherin蛋白的表达。q-PCR表明Garcinone E呈剂量依赖性地上调两种鼻咽癌细胞中E-cadherin的mRNA表达。结论 Garcinone E能够有效抑制鼻咽癌细胞增殖并抑制鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力,其机制可能与抑制鼻咽癌细胞EMT的发生有关。

杨桃根提取物DMDD对α-synuclein PFFs所致分化SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及机制研究

目的:探讨不同浓度杨桃根提取物DMDD对α-突触核蛋白预制原纤维(α-Syn PFFs)所致分化SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及作用机制。方法:使用不同浓度DMDD作用于视黄酸分化的SH-SY5Y细胞,通过MTS测定细胞活力,确定DMDD作用于分化SH-SY5Y细胞的低、中、高浓度;使用不同浓度的DMDD处理5μg/mLα-Syn PFFs诱导的细胞损伤模型,采用Hoechst 33342染色和一氧化氮试剂盒分别检测细胞核损伤细胞数与细胞内一氧化氮产生量;采用蛋白质印迹法检测细胞内酪氨酸羟化酶(TH)、多聚腺苷酸二磷酸(PAR)及多聚腺苷酸二磷酸核糖酶-1(PARP-1)蛋白表达水平;采用免疫荧光技术检测细胞内129位丝氨酸磷酸化α-突触核蛋白(pS129-α-Syn)、磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)阳性细胞数及凋亡诱导因子(AIF)核易位细胞数。结果:Hoechst 33342染色结果显示,与α-Syn PFFs模型组比较,各浓度DMDD处理组出现细胞核损伤的细胞数明显减少(P<0.001);一氧化氮检测结果显示,与α-Syn PFFs模型组比较,各浓度DMDD处理组细胞一氧化氮生成量显著降低(P<0.01或P<0.001);蛋白质印迹法结果显示,与α-Syn PFFs模型组比较,高浓度DMDD处理组细胞TH蛋白表达水平明显升高(P<0.05),而中、高浓度DMDD处理组细胞PAR蛋白表达水平明显降低(P<0.05),高浓度DMDD处理组细胞PARP-1、Cleaved PARP-1蛋白表达水平明显降低(P<0.05);免疫荧光结果显示,与α-Syn PFFs模型组比较,中、高浓度DMDD处理组pS129-α-Syn阳性细胞数明显减少(P<0.05或P<0.01),各浓度DMDD处理组γH2AX阳性细胞数明显减少(P<0.01或P<0.001),AIF核易位细胞数也明显减少(P<0.01或P<0.001)。结论:DMDD可能通过抑制PARP-1/AIF通路介导的PARP-1依赖性死亡途径减轻α-Syn PFFs所致分化SH-SY5Y细胞损伤。

LAMC3低表达与卵巢上皮性癌不良预后的相关性研究

目的探讨层粘连蛋白γ3亚基(LAMC3)表达与卵巢上皮性癌(卵巢癌)患者不良预后的相关性。方法应用免疫组化SP法检测卵巢癌组织(包括商品化标本和本研究标本)中LAMC3蛋白的表达,其中商品化标本为购买的卵巢组织微阵列芯片(包括208份卵巢癌组织和8份癌旁正常卵巢组织)、本研究标本为2005年4月至2012年12月在广西医科大学附属肿瘤医院手术治疗的51份Ⅰc~Ⅳ期卵巢癌组织标本(包括24份化疗耐药组织和27份化疗敏感组织);使用癌症基因组图谱(TCGA)队列数据(489份卵巢癌组织)及临床蛋白质组学肿瘤分析协作组(CPTAC)蛋白质组学数据库(包括100份卵巢癌组织和25份癌旁正常卵巢组织)等开放数据对LAMC3表达与卵巢癌患者预后的相关性进行分析;Pearson χ^(2)检验(双侧)分析本研究标本(51份卵巢癌组织)及TCGA队列数据(489份卵巢癌组织)中LAMC3表达与临床病理指标的相关性;Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析LAMC3表达与无疾病生存时间(DFS)和总生存时间(OS)的关系;采用共表达基因的通路富集和功能聚类分析,探讨LAMC3调控卵巢癌患者预后的可能分子机制。结果商品化标本和本研究标本的免疫组化SP法检测结果及CPTAC蛋白质组学数据库中的数据显示,与癌旁正常卵巢组织、早期(Ⅰ~Ⅱ期)卵巢癌组织及卵巢癌化疗敏感组织相比,LAMC3表达在卵巢癌组织、晚期(Ⅲ~Ⅳ期)卵巢癌组织及卵巢癌化疗耐药组织中均显著下调(P<0.05);且在本研究标本(51份卵巢癌组织)中,LAMC3蛋白低表达与卵巢癌患者的不良DFS及OS显著相关(P<0.01),而这一结果在TCGA队列数据(489份卵巢癌组织)中进一步得到验证,发现LAMC3 mRNA低表达也与不良DFS及OS显著相关(P<0.05)。基于TCGA队列数据(489份卵巢癌组织)中LAMC3共表达基因的通路富集和功能聚类分析表明,卵巢癌中LAMC3基因潜在调控Ras相关蛋白1(Rap1)、有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Ras等癌基因信号通路及细胞外基质(ECM)-受体相互作用和黏着斑等细胞黏附相关通路,进而影响卵巢癌的进展和患者的不良预后。结论LAMC3低表达与卵巢癌患者的不良预后和肿瘤进展相关,有望作为新的卵巢癌治疗靶点和预后标志物应用于临床。

衰老性骨质疏松症小鼠胫骨组织差异表达miRNA筛选及生物信息学分析

目的筛选衰老性骨质疏松症小鼠胫骨组织中差异表达的miRNA,并进行生物信息学分析。方法雄性BALB/c小鼠40只,随机分为衰老组和对照组各20只,衰老组通过D-半乳糖皮下注射法建立衰老性骨质疏松症小鼠模型,对照组皮下注射等量PBS。造模3个月后,分别取两组小鼠胫骨组织,采用miRNA芯片技术分析miRNA表达谱变化,筛选两组差异表达的miRNA。利用DAVID在线数据库对差异表达miRNA进行GO分析和KEGG通路分析,采用STRING在线数据库及Cytospace软件完成miRNA-靶基因—蛋白网络相互作用分析。结果衰老组较对照组表达上调的miRNA有8个,分别为miR-5617-5p、miR-10a-3p、miR-3071-5p、miR-16-2-3p、miR-125b-1-3p、miR-344i、miR-181a-1-3p、miR-1934-3p;表达下调12个,分别为miR-211-3p、miR-31-3p、miR-5619-3p、miR-370-5p、miR-450b-3p、miR-96-5p、miR-5136、miR-344d-2-5p、miR-376b-3p、miR-411-5p、miR-15b-5p、miR-499-3p。靶基因主要在酶结合、蛋白结合和DNA结合等方面发挥作用,涉及细胞连接、液泡和突触等细胞组分,参与蛋白质定位、蛋白质转运和信号调节,调节MAPK信号通路、FoxO信号通路、Ras信号通路等。miR-96-5p、miR-5617、miR-15b、miR-3071与靶基因MAP2K1、UBE2G1、P4HB、VDAC1、CD164有紧密联系,这些靶基因编码蛋白具有相互作用关系。结论miRNA在衰老性骨质疏松症的发生发展过程中可能发挥重要作用,其中miR-96-5p、miR-5617、miR-15b、miR-3071可能通过调控MAP2K1、UBE2G1、P4HB、VDAC1、CD164等参与衰老性骨质疏松症的发生。

多巴丝肼和盐酸多奈哌齐对长期慢性帕金森病模型食蟹猴运动与认知记忆障碍的影响

目的:评价长期慢性1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶( 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)食蟹猴模型(左侧颈内动脉注射MPTP诱导成模后7年)运动与认知记忆功能障碍状态以及多巴丝肼和多奈哌齐干预后的影响。方法:5只慢性PD模型食蟹猴,5只同年龄段健康食蟹猴作为正常对照。分别进行行为学评价,包括Kurlan评分量表评价PD症状严重程度;取食实验(pick up test,PUT)检测上肢精细运动;PAM(physical activity monitoring,PAM)分析24 h运动活动总量及12 h睡眠时段运动活动量的状况。此外,延迟匹配样品比对测试(delay matching-to-sample,DMTS)检测短时认知记忆功能。依次给予多巴丝肼口服10 d,每天2次,每次250 mg,间隔10 d后给予多奈哌齐口服干预14 d,每天1次,每次5 mg,并在分别给予两种药物干预后,测试上述行为学指标变化。结果:长期慢性PD模型Kurlan评分[(4.10±1.01)分]显著高于正常对照组(0分)( P<0.01);右侧上肢与正常对照相比,虽有随意运动但均不能完成取食动作( P<0.01),左侧上肢取食时长[(23.14±7.96)s]与正常对照组[(12.52±2.71)s]相比,差异无统计学意义( P>0.05);24 h运动活动总量[(23 531.75±9 065.85)]与正常对照组[(52 750.34±27 598.89)]相比,差异无统计学意义( P>0.05),12 h睡眠时段运动活动总量[(2 911.34±1 845.47)]与正常组[(3 310.67±1 721.63)]相比,差异无统计学意义( P>0.05);DMTS 5 s、10 s、15 s、30 s延迟后的正确率分别为(61.60±9.21)%、(51.20±11.80)%、(49.60±8.29)%、(60.80±4.38)%,较正常对照组(分别为(96.80±3.35)%、(84.80±8.67)%、(80.80±7.69)%、(74.40±4.56)%)相比显著降低( P<0.01、 P<0.05、 P<0.01、 P<0.01)。给予多巴丝肼干预后,Kurlan评分为(2.60±0.38)分,与给药前[(4.10±1.01)分]相比,差异无统计学意义( P>0.05);右侧上肢仍不能完成操作,左侧上肢取食时长[(15.40±4.14)s]较之给药前[(23.14±7.96)s]缩短( P<0.05);24 h动物运动活动总量[(44 128.25±16 464.71)]高于给药前基线[(23 531.75±9 065.85)]( P<0.05),12 h睡眠时运动活动量(4 931.84±2 304.06)与给药前基线(2 911.34±1 845.47)相比,差异无统计学意义( P>0.05);DMTS 5 s、10 s、15 s、30 s延迟正确率与给药前同样延迟的正确率相比,均差异无统计学意义(均 P>0.05)。给予多奈哌齐干预后与给药前相比,各行为学指标均差异无统计学意义(均 P>0.05)。 结论:长期慢性PD模型仍存在PD症状以及不同程度的运动与认知记忆障碍。多巴丝肼干预后可改善运动损害行为,表明慢性长期PD模型动物脑内多巴胺神经系统功损害持续存在;多奈哌齐干预后对PD症状、运动与认知记忆均无影响,提示造成慢性PD模型食蟹猴的认知记忆障碍的潜在机理与阿尔茨海默病不同。