广西红树林土壤产淀粉酶菌株的筛选及产酶条件优化

目的:从广西石角红树林自然保护区红树林土壤中筛选产淀粉酶菌株,通过Plackett-Burman实验和响应面优化其产酶条件,以期建立高产淀粉酶的发酵工艺。方法:通过平板筛选,从红树林土壤中获得产淀粉酶菌株;通过生理生化与16S rDNA测序确定菌株种类;通过单因素优化,Plackett-Burman实验和响应面优化得出最适产酶条件。结果:从红树林土壤中获得产淀粉酶菌株;鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),命名为Bacillus velezensis MG5-8;获得淀粉酶的最适温度为70℃,最适pH为6.0;经优化获得该菌株产淀粉酶最适温度为30℃,最适产酶碳源为玉米浆粉,最适产酶氮源为黄豆饼粉与牛肉膏;最适产酶条件为黄豆饼粉0.51%、牛肉膏0.55%、玉米浆粉0.34%,在此条件下该菌株的理论酶活性最大值为134.03 U/mL,模型经验证测得B.velezensis MG5-8淀粉酶活性为130.28 U/mL,为理论值的97.2%,是优化前酶活的5.63倍。结论:成功分离出一株产淀粉酶的菌株(B.velezensis MG5-8),在优化的条件下酶活最高为130.28 U/mL。

基于血液自噬相关基因构建的静脉血栓栓塞机器学习模型研究

目的利用生物信息学构建自噬相关基因(autophagy related genes,ATGs)的静脉血栓栓塞(venous thromboembolism,VTE)诊断预测模型。方法根据GSE19151数据集分析VTE人群的差异性ATGs(differentially expressed autophagy-related genes,DE-ATGs)和免疫细胞浸润,建立最优机器学习模型并通过诺谟图、校准曲线、决策曲线分析和外部数据集验证模型的预测效率。结果VTE患者中发现18个差异性表达的ATGs和差异的免疫细胞浸润。诺谟图、校准曲线和决策曲线分析证明机器学习模型对预测VTE具有一定的准确性,其中支持向量机器(support vector machine,SVM)机器学习模型对VTE的预测准确性最高。以SVM模型最重要的5个基因PRKCD、ULK1、CD46、PRKAR1A和FOS作为预测基因,在外部验证数据集表现出令人满意的性能,且与VTE患者的风险有关。结论研究首次揭示自噬与VTE之间的关系,并建立最优的机器学习模型来评估VTE患者的风险。

鸟分枝杆菌耐受表面活性物质基因的筛选及其相关功能分析（英文）

目的:筛选鸟分枝杆菌(MAV)中耐受表面活性物质的基因并探究其相关功能,以认识MAV适应肺部环境的机制。方法:构建MAV基因组文库,采用生物活性水平筛选策略从基因组文库中筛选耐受十二烷基硫酸钠(SDS)的克隆子,运用生物信息学分析该克隆子的完整的开放阅读框架(ORF)及其编码蛋白的二级结构特点。将克隆子的全基因序列与pGEX-4T-3表达质粒连接后转化大肠杆菌,构建过表达目的蛋白的重组菌,然后检测重组菌分别在含SDS、H2O2、NaNO2和GSNO条件下的存活率。结果:成功构建滴度为1.18×10^4 CFU/mL的MAV基因组文库,并从文库中筛选到一个耐受SDS的基因MAV-4012。生物信息学分析显示,MAV-4012蛋白是一个无信号肽的跨膜蛋白,二级结构以α-螺旋为主。过表达MAV-4012重组菌在2%SDS、5 mmol/L H2O2、20 mmol/L NaNO2和10 mmol/L GSNO体外条件下的存活率均比空载菌显著提高(P<0.05)。结论:MAV-4012是MAV中的一个耐受表面活性物质的基因,其编码的蛋白参与了肺部表面活性物质、活性氧(ROS)及活性氮(RNS)的胁迫应答,是MAV重要的毒力因子。

鸟分枝杆菌毒力相关因子EsxH对巨噬细胞凋亡的作用

目的:通过原核表达系统制备鸟分枝杆菌EsxH蛋白,并将其作用于U937细胞,初步探讨其对巨噬细胞凋亡的影响。方法:利用PCR扩增出EsxH编码序列,与表达载体pGEX-4T-3连接,构建重组载体pGEX-EsxH,将重组表达载体pGEX-EsxH转化入E. coli BL21 (DE3),在IPTG作用下诱导表达目的蛋白。用超声破碎仪对菌体进行破碎,取上清通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱纯化GST-EsxH融合蛋白。将纯化后的蛋白作用于U937细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:扩增出基因片段大小为294 bp的EsxH基因,克隆入表达载体pGEX-4T-3,经IPTG诱导后成功表达一个分子量大小为36.5 kDα的融合蛋白GST-EsxH。将不同浓度的EsxH蛋白作用于U937细胞,经流式细胞术检测细胞凋亡率,发现处理组细胞凋亡率高于对照组,其差异具有统计学意义(P <0.05)。结论:EsxH蛋白能够促进U937细胞的凋亡,为进一步研究鸟分枝杆菌的致病机制奠定了基础。

鸟分枝杆菌MAV-2921基因编码蛋白的生物信息学分析及其对巨噬细胞凋亡的影响

目的应用生物信息学软件分析鸟分枝杆菌MAV-2921蛋白的结构和功能,观察其对人源THP-1巨噬细胞凋亡的影响。方法在NCBI数据库中获取鸟分枝杆菌MAV-2921蛋白编码基因及其氨基酸序列信息,运用ProtParam、ProtScale、TMPred、SignalIP、SOPMA、SWISS-MODEL等在线工具对鸟分枝杆菌MAV-2921蛋白进行生物信息学分析。提取全基因组DNA,进行PCR扩增、载体构建得到鸟分枝杆菌MAV-2921基因的重组表达质粒,经诱导表达和分离纯化后获得重组MAV-2921蛋白。将重组蛋白MAV-2921作用于人源THP-1巨噬细胞,ELISA法检测细胞上清液TNF-α表达量的变化,流式细胞术检测巨噬细胞凋亡率。结果鸟分枝杆菌MAV-2921基因全长285 bp,为编码94个氨基酸的蛋白质。该MAV-2921蛋白是稳定的亲水性蛋白,有1个跨膜区段,无信号肽;二级结构以α-螺旋为主,三级结构模型构建显示该蛋白为单体蛋白,不形成二聚体。利用大肠埃希菌表达系统制备了重组鸟分枝杆菌MAV-2921蛋白,将重组MAV-2921蛋白作用于人源THP-1巨噬细胞,与对照组相比细胞上清液TNF-α含量升高(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05)。结论鸟分枝杆菌MAV-2921蛋白为稳定的、亲水性跨膜蛋白,对人源THP-1巨噬细胞具有促凋亡作用。

鸟分枝杆菌中耐受表面活性物质相关基因的分离及功能鉴定

为筛选鸟分枝杆菌中耐受表面活性物质的基因并探究其相关功能,以认识鸟分枝杆菌适应肺部环境的杀(抑)菌机制,本研究构建鸟分枝杆菌基因组文库,采用生物活性水平筛选策略从基因组文库中筛选耐受十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)的克隆子,运用生物信息学分析该克隆子完整的开放阅读框及其编码蛋白的二级结构特点。将克隆子的全基因序列与pGEX-4T-3表达质粒连接后转化大肠杆菌,构建过表达目的蛋白的重组菌。检测重组菌分别在含SDS、H2O2、NaNO2和GSNO条件环境下的存活率。结果表明成功构建滴度为1.18×10^4 cfu/mL的鸟分枝杆菌基因组文库,从文库中筛选到一个耐受SDS的基因MAV-4292。生物信息学分析显示,MAV-4292蛋白是一个无信号肽的跨膜蛋白,二级结构以α-螺旋为主。过表达MAV-4292重组菌在2%SDS、5 mmol/L H2O2、20 mmol/L NaNO2和10 mmol/L GSNO体外条件下的存活率均比空载菌显著提高(p<0.05)。结果表明,MAV-4292是鸟分枝杆菌中一个耐受表面活性物质的基因,它编码的蛋白参与了肺部表面活性物质、活性氧(reactive oxygen species,ROS)及活性氮(reaetive nitrogen species,RNS)的胁迫应答,是鸟分枝杆菌的毒力因子。

鸟分枝杆菌PPE25蛋白对THP-1巨噬细胞免疫效应的影响

[目的]探讨鸟分枝杆菌PPE25在调控人源THP-1巨噬细胞免疫应答反应中的作用及机制。[方法]通过基因扩增、载体构建、诱导表达、分离纯化等过程制备鸟分枝杆菌重组PPE25蛋白;将重组PPE25蛋白作用于THP-1巨噬细胞后,利用流式细胞术检测巨噬细胞凋亡率;运用ELISA方法检测细胞上清中TNF-α的浓度;采取Western Blotting方法检测Bax、Bcl-2、TLR2、TLR4的蛋白表达水平;采用q PCR法检测IL-6、IL-12的mRNA表达水平。[结果]利用大肠杆菌表达系统成功制备重组PPE25蛋白;重组PPE25蛋白作用巨噬细胞后,细胞凋亡率升高(P <0.05),细胞中Bax蛋白表达水平升高(P <0.05),而Bcl-2蛋白表达水平降低(P <0.05);另外,细胞中TLR2、TLR4蛋白表达水平上升(P <0.05),TNF-α含量升高(P <0.05),IL-6及IL-12表达水平升高(P <0.05)。[结论]鸟分枝杆菌PPE25蛋白可以促进人源THP-1巨噬细胞凋亡,并可以通过激活巨噬细胞TLR2或TLR4信号途径促进细胞炎症因子IL-6及IL-12的分泌,从而诱导机体产生免疫应答,抵御鸟分枝杆菌感染。