敲除ACSL3增加HCC细胞对葡萄糖缺乏敏感性

目的:研究长链脂酰辅酶A合成酶3(ACSL3)在代谢应激下对肝细胞癌(HCC)细胞Huh7存活的影响。方法:从TCGALICH数据库下载HCC患者RNA表达谱和临床数据,统计ACSL3在HCC患者中的表达情况,绘制Kaplan-Meier生存曲线;在广西医科大学第一附属医院的HCC队列中收集44例原发性HCC患者组织和癌旁组织样本,通过免疫组化检测ACSL3的表达;利用siRNA和CRISPR/CAS 9技术沉默/敲除Huh7细胞中的ACSL3基因,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)实验、克隆形成实验和Transwell侵袭实验检测ACSL3敲除对Huh7细胞增殖和侵袭能力的影响。在完全培养基和葡萄糖缺乏条件下,通过细胞流式术检测对照组细胞和ACSL3沉默/敲除组细胞的死亡,并检测细胞中ATP、β-羟基丁酸的变化。结果:与正常肝组织相比,HCC组织的ACSL3表达较高(P<0.05),且ACSL3高表达患者生存期较短(P<0.05)。敲除ACSL3不影响Huh7细胞的增殖能力、克隆形成能力以及侵袭能力(P>0.05)。在葡萄糖缺乏下,ACSL3沉默/敲除导致Huh7细胞的存活率显著下降(P<0.05),ATP产生水平下降以及β-羟基丁酸生成受抑制(P<0.05)。结论:通过抑制β氧化,敲除ACSL3促进了HCC细胞死于葡萄糖缺乏。

白脂素包涵体表达纯化及其功能评价

目的构建白脂素的原核表达质粒,表达及纯化重组白脂素蛋白,并初步探索其功能,为进一步研究白脂素作用机制及其生理病理作用提供依据。方法利用基因工程技术构建表达白脂素BL21菌株,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,梯度尿素复性,亲和层析纯化及去内毒素处理得到可用于细胞和动物实验的重组白脂素。采用血糖仪检测重组白脂素腹腔注射后C57小鼠血糖变化情况。Alamar Blue检测重组白脂素作用24 h对MIHA细胞活性的影响;重组白脂素刺激MIHA细胞24 h,用蒽酮法检测糖原含量。结果在37℃,A600 nm=0.8,IPTG终浓度为1 mmol/L诱导4 h目的蛋白表达效果较好。通过纯化和去内毒素处理,重组白脂素纯度大于95%,内毒素含量小于1 EU/mg,可以用于动物与细胞实验。腹腔注射重组白脂素60 min后C57小鼠血糖升高至峰值(重组白脂素组vs对照组P=0.021),120 min恢复到正常水平(重组白脂素组vs对照组P=0.03)。重组白脂素刺激MIHA细胞24 h,对细胞活性没有影响;检测糖原发现,不同浓度白脂素组糖原与对照组比较差异有统计学意义(P1=0.013,P2=0.036,P3=0.011)。结论通过原核表达系统成功表达及纯化了白脂素蛋白,该方法纯化后的白脂素具有降低MIHA细胞糖原含量及升高小鼠血糖的作用,这为白脂素功能的进一步研究提供了理论依据。

多环芳烃暴露与饮酒影响非吸烟人群心理健康状况的交互作用

目的探讨多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)暴露与饮酒影响非吸烟人群心理健康的独立与交互作用。方法本研究对513名广西壮族自治区(简称广西)某大型企业非主动吸烟员工进行问卷调查、心理健康评估。使用一般心理健康问卷量表评估研究对象心理健康状况;尿中羟基多环芳烃(hydroxypolycyclic aromatic hydrocarbons,OH⁃PAHs)水平作为PAHs的内暴露指标;采用logistic回归分析模型和广义线性模型分析PAHs与饮酒的独立和交互作用对心理健康状况的影响。结果本组研究对象年龄为(39.60±6.60)岁,44.2%的职工饮酒,饮酒者多为未婚、男性、有二手烟暴露(均有P<0.05)。logistic回归分析模型结果显示,总体研究对象尿液1⁃羟基萘(1⁃hydroxynaphthalene,1⁃OHNAP)和总羟基萘(total hydroxynaphthalene,ΣOHNAPs)浓度增加会引起人群心理健康状况不良的发生风险增高(OR=1.23,95%CI:1.01~1.49;OR=1.10,95%CI:1.00~1.21;均有P<0.05)。交互分析结果显示,与不饮酒组及低水平尿OH⁃PAHs相比,尿中1⁃OHNAP、2⁃羟基萘(2⁃hydroxynaphthalene,2⁃OHNAP)、ΣOHNAPs和总羟基多环芳烃(total hydroxypolycyclic aromatic hydrocarbons,ΣOHPAHs)浓度与饮酒的交互作用增加中老年人发生心理健康状况不良的风险(OR=3.91,95%CI:1.01~15.11;OR=3.69,95%CI:1.05~12.98;OR=1.96,95%CI:1.01~3.80;OR=1.73,95%CI:1.06~2.93;均有Pint<0.05)。结论PAHs暴露是非吸烟人群心理健康状况不良的危险因素,并且饮酒会增加PAHs对非吸烟中老年人不良心理健康状况的发生风险。

对氨基水杨酸钠对锰染毒大鼠丘脑原代小胶质细胞氧化损伤及炎症反应的影响

[目的]探讨对氨基水杨酸钠(PAS-Na)对体外染锰大鼠丘脑原代小胶质细胞氧化损伤、炎症反应的影响。[方法]将提纯、鉴定后的SD大鼠丘脑小胶质细胞分别给予含不同浓度氯化锰(MnCl_2)(0、200、300、400、500μmol/L)、PAS-Na(50、150、450μmol/L)的完全培养基(DMEM+FBS)培养24 h,采用MTT法检测细胞存活率,根据结果选择染锰的毒性剂量并选定PAS-Na的无毒剂量。随后将细胞随机分为对照组、400μmol/L MnCl_2组、400μmol/L MnCl_2+(50、150、450μmol/L)PAS-Na组、450μmol/L PAS-Na组,共6组。采用MTT法检测各组小胶质细胞存活率;运用DCFH-DA探针标记,荧光倒置显微镜下观察小胶质细胞内活性氧(ROS)的产生情况;ELISA法测定炎症因子白介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α的蛋白分泌量和荧光定量PCR法测IL-1β,TNF-αmRNA表达水平。[结果]400、500μmol/L MnCl_2染毒组的细胞存活率为(85.83±12.53)%、(83.30±6.33)%,低于对照组(均P<0.05),故选择400μmol/L作为锰的染毒剂量;与对照组比较,50、150、450μmol/L PAS-Na组的细胞存活率无明显变化(均P>0.05)。400μmol/L MnCl_2+(50、150、450μmol/L)PAS-Na组的细胞存活率分别为(96.00±18.11)%、(106.13±18.32)%、(110.21±15.13)%,均比400μmol/L MnCl_2组高(均P<0.05)。与对照组比较,400μmol/L MnCl_2组细胞ROS水平、IL-1β和TNF-α的蛋白及mR NA表达水平均升高(均P<0.05)。与400μmol/L MnCl_2组比较,400μmol/L MnCl_2+(50、150、450μmol/L)PAS-Na组的ROS水平、TNF-α分泌量和IL-1βmRNA表达量均降低(均P<0.05),400μmol/L MnCl_2+(150、450μmol/L)PAS-Na组的TNF-αmRNA表达量降低(均P<0.05)。[结论]PAS-Na可减轻锰致大鼠丘脑原代小胶质细胞氧化损伤、炎症反应的程度。

被动吸烟与厨房烹饪条件、烹饪行为及通风状况对非吸烟人群睡眠质量的影响

[背景]被动吸烟是非吸烟人群睡眠质量的危险因素。研究发现不良的厨房烹饪条件、烹饪行为及通风状况也与人群睡眠质量相关。但不良厨房烹饪条件、烹饪行为和通风状况单独作用及与被动吸烟交互作用对非吸烟人群睡眠质量影响鲜有报道。[目的]探讨厨房烹饪条件、烹饪行为和通风状况单独作用及与被动吸烟交互作用对非吸烟人群睡眠质量的影响。[方法]采用整群抽样的方法,于2017年9月对广西某企业514名非吸烟员工进行问卷调查和健康体检。通过问卷收集研究对象的人口学特征、被动吸烟、厨房烹饪条件(如厨房面积)、烹饪行为(如是否加热食用油至冒烟后才炒菜)及通风状况(如通风设备使用情况及通风效果)等。采用匹兹堡睡眠质量指数量表(PSQI)评估研究对象的睡眠质量情况。根据研究目的,进一步排除既往已确诊或自述患有某些慢性疾病、焦虑症和抑郁症者,以及少部分主要信息缺失者,最终本研究共纳入426名研究对象。采用logistic回归模型分析被动吸烟和厨房烹饪条件、烹饪行为、通风状况单独作用及两两交互作用对非吸烟人群睡眠质量的影响。[结果]研究对象PSQI总分为(5.50±0.14)分,被动吸烟组PSQI总分较无被动吸烟组高(P=0.002)。被动吸烟(OR=2.06,95%CI:1.34-3.16)和厨房通风效果不良(OR=2.00,95%CI:1.32-3.04)是非吸烟者总体睡眠质量的危险因素。交互分析显示,与无被动吸烟+良好厨房烹饪条件/烹饪行为/通风状况相比,被动吸烟+厨房面积≤5 m^(2)(OR_(入睡)=2.47,OR_(总体)=2.35,P <0.05)、被动吸烟+加热食用油至冒烟后才炒菜(OR_(总体)=2.59,P <0.05)、被动吸烟+厨房不采用机械通风设备(OR_(日间)=1.97,OR_(总体)=2.13,P <0.05)或厨房通风效果不良(OR_(睡眠时间)=2.13,OR_(日间)=2.58,OR_(总体)=3.86,P <0.05)的非吸烟者发生睡眠质量不好的风险更高。[结论]被动吸烟和厨房通风不良均是非吸烟者总体睡眠质量的危险因素,并且被动吸烟分别与厨房面积≤5 m^(2)、加热食用油至冒烟后才炒菜、厨房不采用机械通风设备或通风效果不良两两同时存在时对非吸烟人群睡眠质量的危害更大。

程序性坏死抑制剂Nec-1对铅致BV2细胞损伤的影响

[背景]程序性坏死与神经退行性疾病的发生和发展关系密切,但铅是否引起神经细胞程序性坏死尚未见报道。[目的]探讨程序性坏死在铅诱导神经小胶质细胞(BV2细胞)损伤中的作用及其抑制剂对铅诱导BV2细胞损伤的影响。[方法]取生长良好的对数生长期BV2细胞,经0、1、5、10、25、50、100、200μmol·L^(-1)醋酸铅分别处理12、24、36、48 h后,采用噻唑蓝法测定细胞存活率。BV2细胞经0、25、50、100μmol·L^(-1)醋酸铅处理24 h后,分别采用酶联免疫吸附试验法、蛋白质免疫印迹法和流式细胞术测定细胞内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)、受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)和混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)的表达情况;并经RIPK1抑制剂Nec-1预处理1 h,检测Nec-1对铅诱导BV2细胞损伤的影响。[结果]BV2细胞的存活率随着铅染毒浓度的增加(r_(12 h)=−0.995,r_(24 h)=−0.984,r_(36 h)=−0.983,r_(48 h)=–0.981,均P<0.01)而下降,在5μmol·L^(-1)醋酸铅染毒下,细胞存活率也随着染毒时间的延长(r=–0.994,P<0.01)而下降。与对照组比较,同一染毒时间,当铅染毒浓度达到10μmol·L^(-1)时即可引起BV2细胞存活率下降(P<0.01)。与对照组比较,25、50、100μmol·L^(-1)铅处理组细胞程序性坏死相关蛋白RIPK1、MLKL蛋白表达升高(P<0.05或0.01),并伴有炎症细胞因子TNF-α含量升高,以100μmol·L^(-1)醋酸铅组最高(P<0.01);50、100μmol·L^(-1)醋酸铅处理组p-RIPK1、p-MLKL及RIPK3表达水平均升高(P<0.01)。此外,与相应染铅组比较,Nec-1预处理使染铅BV2细胞活性升高,坏死及晚凋率降低(P<0.05或0.01)。[结论]铅可致BV2细胞活性降低,坏死率升高,并伴有RIPK3和RIPK1、MLKL蛋白及其磷酸化的表达上调,而RIPK1抑制剂Nec-1对铅引起的BV2细胞损伤具有一定的干预作用,提示程序性坏死可能在铅神经毒性中发挥着重要作用。