PCR-SSCP法快速检测鉴定临床病原菌的探讨

目的 :探讨利用 PCR- SSCP快速检测和鉴别临床病原菌的方法。方法 :采用细菌保守的 1 6 s r RNA基因为模板 ,以 PCR-SSCP方法检测病原菌 ,并以普通 PCR法和 PCR- RFL P法作比较。结果 :普通 PCR法很难从电泳图谱中鉴别细菌 ;PCR-RFCP法电泳图谱虽呈多态性 ,但仍有部分细菌图谱相同和相似 ,不易区分 ;经 PCR- SSCP电泳出来的细菌图谱差异明显 ,可以互相区分。结论 :PCR- SSCP技术能快速简便地检测。

HBVS基因的反义锁核酸对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响

目的:探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)S基因的反义锁核酸(LNA)对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法:将30只HBV转基因小鼠随机分为5组,每组6只.第1组为5%GLU液对照组,第2组为空脂质体对照组,第3组为单LNA组,第4组为S-ASODN脂质体组,第5组LNA脂质体组.反义LNA经尾静脉注入小鼠体内,采用ELISA法检测血清HBsAg;PCR定量检测血清HBVDNA含量;免疫组织化学法检测肝细胞HBsAg的表达;自动生化分析仪检测ALB、ALT、BUN、CR、ApoA1、ApoB等指标;小鼠肝脏、肾脏做常规病理切片HE染色,观察反义LNA对小鼠脏器的影响.结果:注射反义LNA1d、3d、7d、14d后,LNA-脂质体组对血清HBsAg的表达抑制率分别为41.7%、52.8%、57.8%及30.5%.对HBVDNA的抑制率分别为18.5%、36.1%、52.9%和32.7%,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05);全自动生化分析仪检测血清中ALB、ALT、BUN、CR、ApoA1、ApoB等指标,各组结果与对照组比较均无显著性差异(P>0.05);小鼠肝细胞HBsAg的表达显著低于对照组.HE染色显示小鼠肝肾功能及组织学未见异常.结论:HBVS基因反义LNA对乙型肝炎病毒转基因鼠HBV复制和表达有显著抑制作用.

HBV preS2反义锁核酸在HepG22.2.15细胞内的抗病毒效果

目的:探讨针对HBVpreS2基因mRNA翻译起始区的反义锁核酸(LNA)片段在2.2.15细胞内抗HBV复制和表达的作用.方法:分别合成三段互补于HBV preS2基因mRNA翻译起始区同一靶位的反义锁核酸、全硫代反义寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体作为载药体系作用于HepG22.2.15细胞,采用时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)和荧光定量聚合酶链技术(FQ-PCR)动态检测细胞上清液中HBsAg和HBV DNA的含量,并比较其抑制HBV DNA复制与表达的作用;以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测LNA对细胞的毒性.结果:加入LNA后第1天,即出现对HBsAg表达和HBV DNA复制的抑制作用,第7天,未修饰反义寡核苷酸组、全硫代修饰反义寡核苷酸组、反义锁核酸组对HBsAg表达的抑制率分别达45.79%、52.92%和67.21%;对HBV DNA复制的抑制率分别达35.15%、40.69%和52.16%.其中LNA抑制病毒活性最强且对细胞代谢无影响.各组与对照组比较均有显著性差异(均P<0.01),且反义LNA组与其他ASODN组比较也有显著性差异(均P<0.05).结论:针对preS2基因的反义锁核酸体外能有效抑制HBV的复制与表达,故preS2基因可作为乙型肝炎基因治疗的有效靶位.

LNAzyme抑制HCV 5'端非编码区内源性核糖体进入位点基因表达

目的:观察针对丙型肝炎病毒(HCV)5’非编码区(NCR)内源性核糖体进入位点(IRES)的锁核酸核酶对HepG2.9706细胞中HCVRNA表达的抑制作用.方法:设计合成针对HCV5'-NCR区IRES位点的DNAzyme、硫代修饰DNAzyme及LNAzyme.实验设对照组与实验组.对照组包括空白对照组、脂质体对照组、无关DNAzyme对照组、裸DNAzyme对照组.实验组包括脂质体-DNAzyme组、脂质体-硫代修饰DNAzyme组、脂质体-LNAzyme组.观察用药后1、3、5、7d时,对HepG2.9706细胞的HCVRNA及荧光素酶基因表达的抑制效应.结果:脂质体包裹的DNAzyme、硫代修饰DNAzyme及LNAzyme对HCVRNA表达均有抑制作用,平均抑制率分别为28.10%、35.25%和44.58%.对荧光素酶基因表达也有抑制作用,平均抑制率分别为31.18%、40.69%和52.33%.与对照组比较均有显著性差异(P<0.05).对HepG2.9706细胞未见明显细胞毒性作用.结论:LNAzyme对HepG2.9706细胞内HCVRNA的表达具有显著抑制作用,且优于硫代修饰的DNAzyme,是一类特异的高效抗HCV分子药物.