金柑磷酸蔗糖磷酸酶的基因克隆、表达与蛋白结构分析

磷酸蔗糖磷酸酶(SPP)是植物蔗糖生物合成最后一步催化反应的关键酶,对调控植物生长发育不同时期的蔗糖合成过程有重要作用。为探索金柑(Fortunella crassifiolia Swingle)SPP基因及其编码蛋白的序列特征及其在果实发育过程的表达特性,本研究以四倍体品种脆蜜金柑(F.crassifiolia Swingle cv.Cuimi)为试验材料,采用反转录PCR和cDNA末端快速克隆(RACE)方法从金柑果肉中克隆SPP基因,对其进行生物信息学和原核表达分析,并检测果实发育不同时期该基因在果肉中的表达量。结果表明,FcSPP基因的cDNA序列全长1638 bp,最长开放阅读框(ORF)为1191 bp,编码396个氨基酸,理论等电点为6.57,为稳定的亲水性蛋白,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。FcSPP蛋白含有S6PP和S6PP_C保守结构域,属于植物磷酸蔗糖磷酸酶家族成员。系统进化分析结果显示,FcSPP蛋白与甜橙SPP同源性最高,在进化树上与拟南芥等双子叶植物SPP划归为一类。此外,本研究构建了FcSPP基因的原核表达载体,诱导表达获得纯化的FcSPP蛋白,分子量鉴定为45.96 kDa。定量分析结果表明,脆蜜金柑果实发育4个时期FcSPP基因相对表达量呈逐步上升趋势,果实膨大期、成熟期的果肉组织中该基因表达量显著高于初果期和生长期(P<0.05)。本研究为解析金柑果实蔗糖生物合成的分子机制及调控蔗糖生物合成相关基因的研究提供了理论基础。