mRNA疫苗制备技术在甲型流感病毒疫苗研究中的应用

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、H1N1和H3N2亚型人流感病毒(Influenza virus,IV)均属于甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)。IAV含有多种亚型,毒株变异快,因此IAV疫苗株需要根据当年的优势毒株进行相应的调整,这给疫苗的研制和生产带来巨大挑战。信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)疫苗制备工艺简单、生产时间短且容易规模化生产,在疾病预防方面具有广阔的应用前景。笔者对mRNA疫苗的种类、优化策略和IAV mRNA疫苗的研究现状进行了综述,旨在为IAV mRNA疫苗的研发提供理论参考。

广西猪繁殖与呼吸综合征病毒感染情况调查及其欧洲型毒株ORF5基因变异分析

为了解广西近期猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染情况及其欧洲型PRRSVORF5的遗传变异特点,2020年6月至2021年5月,采集广西14个设区市疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪病料、血清共782份,进行PRRSV的qRT-PCR分型检测及ORF5基因扩增,并运用SPSS23.0、DNAStar、MEGA X等生物学软件对检测结果及获得的PRRSVORF5基因序列进行分析。结果显示:样品检测总阳性率为29.54%,其中欧洲型(PRRSV-1)PRRSV阳性率为6.78%,美洲型(PRRSV-2)PRRSV阳性率为22.76%,表明受检猪群普遍存在PRRSV感染;在不同设区市中,贵港、崇左感染率最高(50.00%);在不同季度中,冬季感染率最高(41.00%);在不同年龄阶段猪群中,保育猪感染率最高(53.42%);感染主要以PRRSV-2为主,新发PRRSV-1感染;广西新发PRRSV-1在ORF5基因上存在相同独特的核苷酸及氨基酸变异特点,与中国香港分离欧洲株HKEU16亲缘关系较近,可能是在引种等贸易过程中所引进,并在饲养环境、免疫压力等多种因素的作用下发生了一定的变异;广西近期受检猪群普遍存在PRRSV-2感染,新出现PRRSV-1的感染,猪场应重视并及时调整、实施针对性的PRRS防控计划。

H1亚型禽流感病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的建立及应用

以H1亚型AIV的HA基因为研究对象,采用重组聚合酶核酸等温扩增技术(RPA),通过RT-PCR方法优选出1套引物,进而优化体系的反应温度、最佳探针及引物浓度,使用优化后的最佳反应体系进行敏感性及特异性试验,并探索该方法能达到的最短反应时间,利用侧向流动免疫(LFD)试纸条观测反应后的结果,最终建立检测H1亚型AIV的RT-RPA-LFD快速检测方法。结果表明:建立的RT-RPA-LFD快速检测方法在探针工作浓度为0.14 mmol/L,37℃条件下反应20 min,可最低检测到1.5×10^(2)copies/反应的H1亚型AIV RNA,其他常见家禽病原体未见阳性反应。该方法与RT-PCR及鸡胚分离鉴定测序结果完全一致,可满足H1亚型AIV临床快速鉴别诊断的需求,为基层兽医现场快速检测提供技术支撑。

基于网络药理学和分子对接探究黄连解毒散治疗猪传染性胃肠炎的作用机制

为探究黄连解毒散(HLJDS)治疗猪传染性胃肠炎(TGE)的作用靶点及作用机制,本研究通过中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)检索HLJDS中的所有化学成分,以口服生物利用度(OB≥30%)、类药性(DL≥0.18)为条件筛选HLJDS的活性化合物及HLJDS活性化合物潜在靶点的数量和名称。利用Gene cards数据库和CTD数据库检索与筛选TGE的相关靶点和HLJDS作用于TGE的相关靶点。采用微生信在线Venn图制作工具分析HLJDS活性化合物和TGE的共同靶点。将上述数据采用Cytoscape 3.9.1软件构建中药-活性化合物-靶点的网络,其中度值>32的化合物可能是关键的化合物或者作用靶点。将HLJDS作用于TGE的相关靶点上传至STRING数据库,获得HLJDS作用于TGE的PPI网络。利用Cytoscape软件中的相关工具分析靶点的网络拓扑学参数,并通过这些参数筛选HLJDS作用于TGE的关键靶点。结果显示,从HLJDS共筛选到77个活性成分和825个药物作用靶点,并筛选到950个TGE相关靶点,其中HLJDS的活性成分与TGE交集的靶点有202个。中药-活性化合物-靶点的网络图结果显示,HLJDS通过77个有效活性化合物作用于202个HLJDS与TGE交集的靶点。PPI网络分析结果显示,肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子受体(EGFR)、一氧化氮合酶3 (NOS3)、Toll样受体4 (TLR4)与信号转导和转录活化因子3(STAT3)等31个靶点可能是HLJDS治疗TGE的关键靶点。通过DAVID数据库对HLJDS作用于TGE的相关靶点进行GO功能分析和KEGG信号通路富集分析。采用Auto Dock Vina 1.1.2将HLJDS度值前6的主要活性化合物PPI网络中前6的关键靶点进行分子对接并获得结合能。将度值前15的HLJDS活性化合物和关键靶点TLR4、TNF-α进行分子对接,通过结合能预测HLJDS活性化合物及对照化合物(姜黄素和维A酸)与TLR4、TNF-α的分子对接效果。GO功能和KEGG信号通路分析结果显示,HLJDS作用于TGE的相关靶点涉及生物过程333个、细胞组分51个、分子功能88个主要功能;涉及AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路和沙门氏菌感染等与TGE相关的信号通路。分子对接结果显示,HLJDS 6个主要活性化合物与6个关键核心靶点均能够自发结合。且相较于对照化合物姜黄素和维A酸,HLJDS中的黄藤素、黄连素、黄芩素和槲皮素等14个活性化合物与TLR4、TNF-α的结合能更低,结合效果更好。上述结果表明,HLJDS可通过多成分、多靶点、多信号通路作用于TGE的相关靶点,发挥治疗TGE的作用。本研究为HLJDS的进一步开发与应用提供研究基础与方向。

鸽Ⅰ型副黏病毒、圆环病毒和疱疹病毒混合感染的诊断

研究旨在确诊广西某肉鸽场中出现神经症状的病鸽并为该场提供相应的防治方案,通过临床诊断、病理解剖、分子生物学检测、细菌分离、病毒分离等方法对广西某肉鸽场病鸽进行诊断。结果显示,剖检可见病鸽肝脾肿大、坏死,花斑肾;分子生物学检测结果显示,鸽Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1)、圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)和疱疹病毒(pigeon herpesvirus,PiHV)为阳性;对病样进行细菌培养,结果未分离到细菌;将病样接种SPF鸡胚进行病毒分离,结果显示,尿囊液血凝效价稳定在8 log2,其血凝性可被新城疫病毒(NDV)阳性血清抑制,但不能被禽流感病毒(AIV)阳性血清抑制。研究表明,最终诊断结果为PPMV-1、PiCV和PiHV混合感染。

鸡细小病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种可定量检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)新型检测方法。引物设计参考了GenBank中ChPV的NS基因保守序列,筛选了特异性探针引物组,采用不同探针引物浓度组合和退火温度梯度对反应条件进行优化,并通过使用该方法与荧光定量PCR(qPCR)和普通PCR方法进行灵敏度比较,同时对其他常见禽病病原体进行检测,以及对40份临床样品进行检测,评估了该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法最佳引物浓度均为900 nmol/L,最佳探针浓度为600 nmol/L;最佳退火温度为54.0℃;灵敏度比qPCR和普通PCR分别高10倍和1000倍,最低检测限为4.5 copies/μL;对其他常见禽病病原体进行ChPV微滴式数字PCR检测,结果均为阴性;批内和批间重复性较好,变异系数小。结果表明,所建立的ddPCR方法具有更高的敏感性和准确性,可成功用于快速定量检测ChPV感染。

猪德尔塔冠状病毒N蛋白单克隆抗体2D7的制备与生物学特性鉴定

为获得猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并鉴定其生物学特性,本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因,构建表达质粒,转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌,诱导表达后获得PDCoV-N重组蛋白,将其进行纯化后再免疫小鼠,制备针对PDCoV-N蛋白的mAb,并进行了抗体的效价测定、免疫荧光(IFA)、Western blot、亚类的鉴定、mAb特异性的鉴定。结果,成功构建pColdⅡ-PDCoV-N重组原核表达质粒,SDS-PAGE显示重组N蛋白成功表达,分子质量约为38 kDa;经小鼠免疫、细胞融合、亚克隆筛选获得1株分泌PDCoV-N蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株;制备的腹水经间接ELISA方法测定抗体的效价为2.048×10^(6)。IFA、Western blot试验表明该mAb可以与PDCoV-N蛋白及全病毒特异性结合,亚类鉴定其亚型为IgG1,轻链为κ链。该mAb只与PDCoV反应,而与其他猪肠道病毒无交叉反应,表明本研究制备的mAb具有良好的特异性。本研究成功制备了PDCoV-N蛋白的mAb,为进一步研究PDCoV的生物学特性和诊断试剂的开发提供技术支持。