广西道地药材肉桂及阴香的DNA分子鉴定研究

建立一种能够准确鉴别肉桂及阴香的特异性聚合酶链式反应方法,以保障肉桂用药的安全性和有效性。通过对比分析肉桂及阴香的psbA-trnH序列差异找到特异性单核苷酸多态性位点,设计特异性引物,通过优化退火温度、循环次数,评估不同聚合酶种类和不同基因扩增仪等扩增条件对不同来源的肉桂及阴香进行特异性扩增,根据特异性扩增条带进行鉴别。结果表明退火温度为54℃,循环次数为35次时,肉桂经肉桂特异性引物扩增后在100~200 bp处出现特异性条带,阴香无条带;退火温度为56℃,循环次数为40次时,阴香经阴香引物扩增后在200~300 bp处出现特异性条带,肉桂无条带。该研究所建立的特异性PCR方法可以快速准确鉴别出肉桂及阴香,为控制肉桂的质量安全提供参考。

白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量分析及风险评价

目的建立超高效液相色谱串联质谱法(ultra performance liquid chromatograph tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)测定白背三七中芝麻菜叶千里光碱-N-氧化物、春千里光碱、野百合碱、春千里光碱-N-氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱和千里光宁碱的含量,依据检测结果对其进行初步风险评价。方法用Agilent Poroshell 120 SB-C_(18)色谱柱(150 mm×3.0 mm,2.7μm),流动相A为1 mL·L^(-1)甲酸和5.0 mmol·L^(-1)甲酸铵水溶液,B为1 mL·L^(-1)甲酸的甲醇,梯度洗脱。电喷雾离子源,正离子多反应模式监测。结果7种吡咯里西啶生物碱在各自质量浓度范围内线性关系良好(r>0.9970);平均加样回收率为89.31%~92.16%,RSD值为2.02%~3.48%。5批白背三七样品中倒千里光碱的含量范围为158.76~1714.89μg·kg^(-1)。结论建立的UPLC-MS/MS法稳定可行,可为白背三七中吡咯里西啶生物碱的质量控制和安全性评价提供科学依据。

HPLC-ELSD法和UPLC-MS/MS法评价石斛夜光丸中人参投料掺伪情况

目的建立石斛夜光丸中人参混淆品(西洋参)掺伪的检测方法,考察样品中人参的投料情况。方法分别采用HPLC-ELSD和UPLC-MS/MS法进行分析测定。HPLC-ELSD法:采用CAPCELL PAK C18 MGⅢ(S-5)(4.6 mm×250 mm,5μm)柱,以乙腈-水为流动相,流速为1.0 mL·min^(-1),柱温30℃,ELSD漂移管温度为105℃,气体流速为3.0 L·min^(-1);UPLC-MS/MS法:采用电喷雾离子源(ESI-),多反应监测(MRM)模式。结果91批石斛夜光丸中有35批样品检出西洋参。结论所建立方法专属性、重复性、稳定性、耐用性良好,可为石斛夜光丸中人参的质量控制与评价提供可靠方法。

TLC联合UPLC-QQQ-MS分析天王补心丸中4种外源性污染成分

目的对天王补心丸质量分析中发现的异常成分进行研究,建立薄层色谱(TLC)、超高效液相色谱—三重四极杆质谱(UPLC-QQQ-MS)同时测定天王补心丸中盐酸小檗碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀等4种外源性污染成分的分析方法。方法采用TLC法,通过优化展开系统,对158批样品进行定性鉴别;针对异常斑点,采用HPLC-Q/TOF-MS进行成分鉴定确认;采用UPLC-QQQ-MS进行定量分析。结果158批天王补心丸样品中有9批检出盐酸小檗碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀等4种外源性污染成分,分别在0.97~483.34、0.98~98.49、1.00~100.50、0.88~87.75ng·mL^(-1)内呈线性,回收率为99.30%~103.99%,平均标准偏差(RSD)为0.90%~2.62%(n=6),9批样品中上述4种成分的含量分别为20.3~104.1、1.0~17.6、0.4~30.6、3.2~24.8μg·g^(-1)。结论该方法简便、准确、专属性强,可为天王补心丸的质量控制提供参考。

一测多评法同时测定广西民族药野菠菜中4种成分的含量

目的:建立一测多评法同时测定广西民族药野菠菜中4种蒽醌类成分含量的方法,并对建立起的野菠菜含量测定方法进行可行性验证。方法:采用Waters XBridge C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相为甲醇-0.1%磷酸(梯度洗脱);流速:1.0 mL/min;波长:254 nm;柱温:25℃;进样量:10μL。以大黄酚为该含量测定方法的内参物,通过相对校正因子对芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚4种蒽醌类成分进行含量测定。同时采用外标法对12批野菠菜药材中4种蒽醌类成分进行含量测定研究。结果:建立了野菠菜中大黄酚与芦荟大黄素、大黄素及大黄素甲醚的相对校正因子;所建立的一测多评含测方法的计算值与外标法的实测值无明显差异(RSD<5%)。结论:一测多评法可用于野菠菜中4种不同成分的同步测定。

启脾丸中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)含量测定及安全性评价

目的建立高效液相色谱法测定启脾丸中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)的含量,并评价启脾丸中黄曲霉毒素安全性。方法样品提取后通过免疫亲和柱处理,采用HPLC-柱后衍生-FLD法对全国10个生产企业的64批启脾丸进行测定。结果启脾丸中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)的平均回收率为84.09%、84.38%、83.11%、86.33%,RSD为2.5%、2.0%、2.8%、1.9%,64批启脾丸中52批检出黄曲霉毒素,检出率为81.2%,不合格率为9.4%,部分样品存在黄曲霉毒素污染的问题。结论该方法操作简便,结果稳定可靠,可为该制剂的质量安全控制提供依据。

相思子及其混淆品的特异性PCR鉴别

目的:建立一种快速鉴别相思子及其混淆品的特异性聚合酶链式反应(PCR)方法。方法:通过比对相思子及其混淆品的ITS2、rbcL和psbA-trnH基因序列,寻找SNP位点并设计特异性引物;筛选并优化反应体系及反应条件;同时进行方法学考察和可行性验证。结果:在psbA-trnH的序列区域设计特异性引物,仅有相思子DNA基因组能扩增出约200~300 bp的目标条带,而在同样条件下,混淆品均无此条带。结论:该研究所建立的相思子特异性PCR方法可快速、准确地鉴别相思子及其混淆品,具有推广应用的价值。

更年灵胶囊4种成分的含量测定及HPLC指纹图谱的建立

目的建立HPLC法同时测定更年灵胶囊中女贞子和淫羊藿中特女贞苷、淫羊藿苷、朝藿定B、朝藿定C的含量并建立HPLC指纹图谱,同时进行聚类分析和主成分分析。方法用HPLC法,色谱柱为Capcell pak MGII-C_(18)(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-水(梯度洗脱),流速为1.0 mL·min^(-1),检测波长为224 nm,柱温为30℃,进样量为10μL。结果4种成分在各自范围内线性关系良好(r≥0.9999),平均加样回收率为97.10%~102.77%,RSD值为1.24%~1.86%。20批样品的HPLC图谱有11个共有峰,指认了4个峰,分别为特女贞苷、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷。结论HPLC指纹图谱准确、可靠,所建立的含量测定方法简便、可行、重复性好,可用于更年灵胶囊的质量控制。

液质联用法测定十一味参芪片中马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ

目的:建立十一味参芪片中马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ的液相色谱-质谱法(LCMS)检测分析方法。方法:Kromasil Proshell C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.5μm),以乙腈-0.1%乙酸水溶液(含10 mmol·L^(-1)乙酸铵)为流动相,梯度洗脱,流速0.3 mL·min^(-1);多反应监测模式,马兜铃酸Ⅰ为m/z 359.1→298.1(定量)和m/z 359.1→296.1(定性),马兜铃酸Ⅳa为m/z 375.1→312.2(定量)和m/z 375.1→297.2(定性),马兜铃内酰胺Ⅰ为m/z 294.1→279.0(定量)和m/z 294.1→251.1(定性),建立十一味参芪片中3个马兜铃酸类成分的LC-MS,在方法学验证的基础上对所有样品进行检测分析。结果:马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ进样量分别在2.0197~100.9829、1.9478~116.8656、1.9718~98.5880 pg时线性关系良好(r>0.999),定量限分别为1、6、2 pg,加样回收率分别为92.95%(RSD为2.28%)、80.09%(RSD为4.16%)、104.89%(RSD为3.24%)。14批十一味参芪片样品中马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ⅰ的检出量分别为21.0~47.6、185.0~506.1、164.4~426.0 ng·g^(-1)。结论:所建立的方法快速、准确、灵敏、可靠,能够用于十一味参芪片中上述马兜铃酸类成分的筛查与分析,可为其安全性有关成分研究提供参考。

高效液相色谱-串联质谱法测定天王补心丸中山麦冬

建立超高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定天王补心丸中麦冬的混淆品山麦冬(湖北麦冬、短葶山麦冬)的方法。样品经甲醇提取,以0.1%(体积分数)甲酸-乙腈为流动相,用Waters CORTECS®C18色谱柱分离,采用电喷雾离子源(ESI),以多反应监测(MRM)模式进行正、负离子同时扫描,用HPLC-MS/MS法测定湖北麦冬、短葶山麦冬的代表性成分山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C。山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C的质量浓度分别在5.18~207.4、5.2~2080 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好,相关系数均为0.9993,方法检出限分别为56、134 ng/g。样品加标回收率分别为99.16%、101.54%,测定结果的相对标准偏差分别为2.57%、5.27%(n=9)。该方法简单、稳定、可靠,可用于分析天王补心丸中麦冬的掺假情况。

三七总皂苷肠溶微丸的含量测定及体外释放度考察

目的:建立三七皂苷R_(1)、人参皂苷Rg_(1)和人参皂苷Rb_(1)在三七总皂苷(PNS)肠溶微丸中的含量测定方法,并考察其体外释放度,为其质量控制提供依据。方法:采用HPLC法,色谱柱为XB-C_(18)(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈-水,梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^(-1),柱温为30℃,检测波长为203 nm,加样量为20μL。按照2020年版《中华人民共和国药典》通则0931溶出度和释放度测定法,测定PNS在酸中和磷酸盐缓冲液中的释放度。结果:供试品中3种皂苷分离良好,线性关系良好;三七皂苷R_(1)、人参皂苷Rg_(1)和人参皂苷Rb_(1)的线性范围分别为3.477~111.250、4.517~114.985、4.783~152.100μg·mL^(-1);检测限分别为0.584、0.631、0.565μg·mL^(-1),3批制剂中三七皂苷R_(1)、人参皂苷Rg_(1)和人参皂苷Rb_(1)含量分别为10.40%、53.01%、32.49%,与PNS原料中的含量无明显差异,说明PNS主要有效成分的含量在制备过程中没有发生明显变化;三七皂苷R_(1)、人参皂苷Rg_(1)和人参皂苷Rb_(1)在酸中释放量<10%,在pH值=6.8的磷酸盐缓冲液中45 min累积释放量>70%,说明3批制剂的体外释放度具有良好的稳定性和重现性。结论:该方法可以准确、快速的实现PNS肠溶微丸中多种皂苷类成分的定量测定,可用于PNS肠溶微丸的质量控制。

HPLC-一测多评法同时测定壮药罗汉茶中6种黄酮类成分及多元统计分析

目的:建立同时测定罗汉茶中新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷和黄杞苷含量的方法,并进行多元统计分析。方法:采用高效液相色谱-一测多评法。色谱柱为Phenomenex SuperLu C18,流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液(19∶81,V/V),检测波长分别为254 nm(新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、黄杞苷)、291 nm(槲皮苷),流速为1.0 mL/min,柱温为30℃,进样量为10μL。以落新妇苷为内参物,计算其他5种成分的相对校正因子,再根据相对校正因子计算各成分的含量,并与外标法进行比较;采用SPSS 22.0软件进行聚类分析和主成分分析。结果:新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷和黄杞苷检测进样量的线性范围分别为0.007~0.311、0.871~18.184、0.002~0.119、0.052~1.251、0.105~2.202、0.020~2.319μg(r>0.999);精密度、重复性、稳定性(24 h)试验的RSD均小于3%;平均加样回收率分别为97.32%、94.89%、97.15%、96.90%、97.52%、97.53%(RSD为1.09%~2.60%,n=6)。新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷相对于落新妇苷的平均相对校正因子分别为1.2526、1.1983、0.9586、0.8071、1.1381。一测多评法测得新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷等5种成分的含量分别为0.3942~2.0672、0.1391~0.8047、2.8648~8.5548、4.5812~11.3711、1.0289~13.4015 mg/g;外标法测得新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷和黄杞苷等6种成分的含量分别为0.3672~1.9253、46.3611~126.3421、0.1381~0.7988、2.9662~8.8578、4.6425~11.5233、0.9706~12.6419 mg/g;两种方法含量测定结果的相对误差均不高于3.55%。聚类分析结果显示,9批罗汉茶样品可聚为两类,S8聚为一类、其余聚为一类。主成分分析结果显示,前2个主成分的累计方差贡献率为84.745%,分类结果与前者一致。结论:所建高效液相色谱-一测多评法准确、可行,重复性良好,可用于罗汉茶中6种黄酮类成分的同时测定,并可为其质量控制提供参考。

石斛夜光丸中麦冬掺伪情况考察

目的:建立眼科经方石斛夜光丸中麦冬的混淆品山麦冬(湖北麦冬、短葶山麦冬)的检查方法,考察样品中麦冬的投料状况。方法:应用超液相色谱-串联电喷雾三重四级杆质谱(HPLC-MS-MS)技术,采用Waters CORTECS® C_(18)色谱柱(2.1 mm×100 mm, 2.7μm),以0.1%甲酸-乙腈为流动相,梯度洗脱,流速:0.25 ml·min;,柱温:35℃,采用电喷雾离子源(ESI^(±)),以多反应监测(MRM)模式进行正、负离子分别扫描。结果:山麦冬的特征成分山麦冬皂苷B与短亭山麦冬皂苷在相应线性范围内线性关系良好(r>0.999),平均加样回收率为99.03%、97.96%,RSD均小于3.9%(n=9),91批石斛夜光丸样品检出山麦冬22批。结论:石斛夜光丸中存在麦冬和山麦冬的混用情况。

天王补心丸的研究进展

天王补心丸是中医经典名方,由16味中药组成的复方制剂,化学成分种类繁多,具有补血、镇静安神、抗焦虑、改善微循环、改善记忆等作用,临床常用于治疗失眠症、心肌病、心律失常、心脏神经官能症、抑郁症等有较好疗效。文章综述了天王补心丸的化学成分、药理作用、作用机制和临床应用,为其进一步开发和质量标准完善提供依据。

位点特异性PCR鉴别两面针掺伪飞龙掌血的方法研究

目的:探讨DNA条形码技术对鉴定两面针掺伪飞龙掌血的可行性,建立两面针特异性快速聚合酶链式反应(PCR)分子鉴定方法。方法:通过对两面针和伪品飞龙掌血DNA条形码进行对比分析,寻找单核苷酸多态性(SNP)位点并设计特异性鉴别引物,优化PCR反应体系与程序,进行退火温度、引物酶、反应循环数、灵敏度及专属性等方法学考察。结果:ITS2条形码适用于两面针及伪品飞龙掌血的鉴别,所建立的位点特异性PCR鉴别方法,在退火温度为56℃、循环数为33次时,伪品飞龙掌血经过特异性引物扩增后,在200~300 bp之间检出一条单一DNA条带,而两面针则无此条带。结论:所建立的位点特异性PCR方法可准确检测两面针中是否含有飞龙掌血,为两面针质量监测提供一种新型的鉴定手段。

天王补心丸中炒酸枣仁掺伪情况的研究

目的:建立天王补心丸中炒酸枣仁的混淆品炒理枣仁的检查方法,测定127批天王补心丸(水蜜丸、大蜜丸)样品,以考察样品中炒酸枣仁的投料状况,予相关生产企业及监管部门警示。方法:应用高分离度快速液相色谱-三重串联四极杆质谱(UPLC-QQQ/MS)技术,采用Agilent Eclipse C18(100 mm×2.1 mm,1.8μm)色谱柱,以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速0.2 mL·min^(-1),柱温30℃,进样量1μL;采用电喷雾离子源(ESI),以多反应监测(MRM)模式进行正离子扫描。结果:在所设立的色谱条件下,欧鼠李叶碱在相应线性范围内线性关系良好(r>0.999),水蜜丸与大蜜丸中欧鼠李叶碱的加样回收率(n=9)分别为99.13%、97.16%,RSD均<3.3%。用所建立的方法测定127批天王补心丸样品,检出炒理枣仁15批。结论:天王补心丸中存在以炒理枣仁代替炒酸枣仁投料的情况。

GC-MS/MS测定宽胸气雾剂中12种指标成分

目的:建立气相色谱-三重四极杆质谱(GC-MS/MS)同时测定宽胸气雾剂中桉油精、龙脑、甲基丁香酚、异龙脑、α-红没药醇、榄香素、反式橙花叔醇、石竹烯、α-葎草烯、β-蒎稀、α-蒎稀、左旋樟脑等12种指标性成分方法。方法:采用内标法,样品经乙醇稀释,GC-MS/MS测定,程序升温,MRM模式检测;并使用热图聚类和主成分分析法对数据进行统计分析。结果:12种指标成分分别在1~10 ng·mL^(-1)和50~1000 ng·mL^(-1)两个量级内呈线性;回收率为97.5%~104.8%,RSD为1.14%~2.89%(n=3);8批样品中上述成分含量分别为22.24~26.79,22.22~26.88,20.74~22.99,13.72~16.78,10.25~11.23,5.25~5.81,4.60~4.78,2.63~3.06,2.18~2.47,1.92~2.18,1.55~1.94,1.02~1.07 mg·mL^(-1);热图聚类分析结果表明同一企业不同批次样品整体质量一致性较好。结论:该方法专属性强、灵敏度高、测定方法简便结果准确,可为宽胸气雾剂的质量控制提供检验依据。

肉豆蔻指纹图谱研究及成分解析

目的建立肉豆蔻药材的质量控制方法。方法以去氢二异丁香酚为参照峰确定共有峰,建立肉豆蔻HPLC指纹图谱;利用高分辨液质联用色谱法对共有峰进行分析,通过对特征峰一级质谱、二级质谱数据的计算及数据检索,指认共有峰的化学成分。结果建立了肉豆蔻的HPLC指纹图谱,10批样品的相似度均在0.9以上;共建立11个共有峰,根据高分辨液质联用色谱分析结果,对11个共有峰进行成分指认,11个化合物分别是甲基丁香酚(峰1)、利卡灵A(峰2)、肉豆蔻醚(峰3)、Odoratisol A(峰4)、2-(3,4-Dimethoxyphenyl)butanoic acid(峰5)、malabaricone D(峰6)、5’’-Methoxy dehydrodiisoeugenol(峰7)、去氢二异丁香酚(峰8)、Malabaricone C(峰9)、4-Methoxy-6-{(2S,3S)-7-methoxy-3-methyl-5-[(1E)-1-propen-1-yl]-2,3-dihydro-1-benzofuran-2-yl}-1,3-benzodioxole(峰10)、利卡灵B(峰11)。结论建立的肉豆蔻HPLC指纹图谱可用于肉豆蔻药材的质量评价;利用高分辨液质联用色谱技术快速分析复杂成分的化学组成方法,对中药提取物及其制剂化学成分的鉴别分析具有一定的参考价值。