不同穿膜肽载体转染对猪精子受精能力的影响

【目的】明确修饰基因组通过穿膜肽载体转染精子的可行性及穿膜肽载体对精子和受精卵的影响,为实现安全有效地大批量制备猪转基因胚胎提供技术支撑。【方法】以水牛Sohlh2基因为目的基因,通过细胞穿膜肽(C105y、MPG和TAT)和慢病毒介导转染猪精子后,采用激光共聚焦扫描显微镜观察转染精子形态特征的变化,利用精子图像分析仪(CASA)检测精子活率、平均曲线运动速度(VCL)、平均直线运动速度(VSL)和前向性(STR)等指标,运用精子顶体染色试剂盒测定猪精子顶体反应,并通过体外受精进一步验证不同载体转染制备生产转Sohlh基因猪胚胎的效果。【结果】转染后的猪精子顶体结构完整,细胞膜未见破裂;不同细胞穿膜肽(C105y、MPG和TAT)的猪精子转染阳性率分别为56.74%、50.44%和43.58%,低于慢病毒的转染阳性率(61.48%),但差异不显著(P>0.05,下同)。经穿膜肽C105y转染24 h,猪精子活率(70.09%)、平均直线运动速度(35.36μm/s)、平均曲线运动速度(42.20μm/s)、前向性(1.03μm/s)与对照组相比差异均不显著;而经穿膜肽MPG和TAT及慢病毒转染后,猪精子的各项指标均呈一定程度的下降趋势。细胞穿膜肽转染猪精子的自发顶体反应率与对照组相比无显著差异,慢病毒转染则呈显著的上升趋势(P<0.05,下同);在诱发顶体反应率方面,慢病毒转染猪精子的诱发顶体反应率较对照组呈显著下降趋势,而不同细胞穿膜肽转染对猪精子诱发顶体反应率也无显著影响。慢病毒和穿膜肽C105y转染猪精子经体外受精获得的受精卵继续培养24 h后其卵裂率为64.82%和65.91%,与对照组受精卵的卵裂率(64.52%)差异不显著;穿膜肽C105y转染组的囊胚率(15.82%)与对照组间无显著差异,而慢病毒转染组的囊胚率(9.11%)显著低于对照组;在转基因胚胎阳性率方面,穿膜肽C105y转染组显著低于慢病毒转染组(8.54%vs 10.38%)。【结论】穿膜肽C105y对猪精子的受精能力及转基因猪胚胎发育影响小,且毒害作用不明显,是一个能高效转导外源基因的安全载体。