华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶参与囊蚴脱囊的作用研究

目的探讨华支睾吸虫重组半胱氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶特异抑制剂对脱囊的促进或抑制作用。方法用人工消化法收集囊蚴;采用体外脱囊,每组囊蚴100个,实验组分别加入N-(反式-环氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(E-64)(20、40μmol/L)、碘乙酸(IAA)(50、100μmol/L)、华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶成熟结构域(CsCPL-m)与囊蚴孵育,对照组仅加入缓冲液,37℃,30 min;弃掉液体后加入10μg/mL胰蛋白酶-PBS溶液(pH 7.5),每5 min计数1次脱囊数,共计数6次,计算脱囊率;体视显微镜下将每组脱囊后的空囊分为三类计构成比。结果rCsCPL-m处理组与对照组在5、10 min脱囊率接近,差异均无统计学意义(χ^(2)=0.070、0.163,P均>0.05),到15 min时,两组脱囊率均达到99%。E-64与IAA处理组在5、10、15、20 min脱囊率均低于对照组,差异均有统计学意义(χ^(2)=73.895、286.003、203.959、41.451,P均<0.001);25 min时E-64(20、40μmol/L)与IAA(100μmol/L)组脱囊率仍低于对照组,差异均有统计学意义(χ^(2)=10.318、11.428、16.807,P均<0.001);IAA处理组,在6个统计时间点均显示50μmol/L组的脱囊率高于100μmol/L处理组,差异均有统计学意义(χ^(2)=10.285、22.623、14.654、12.934、7.789、4.308,P均<0.05)。rCsCPL-m组空囊形态3种类型构成比与对照组比较差异无统计学意义(χ^(2)=2.993,P>0.05);E-64和IAA作用组与对照组比较,均显示A型占比减少,C型占比增加,差异均有统计学意义(χ^(2)=21.495、17.324,P均<0.01)。结论华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶可能通过对囊壁内层的酶解软化作用促进脱囊,而CsCPL是否参与脱囊还需进一步确定。

华支睾吸虫囊蚴脱囊的超微结构观察

目的利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对华支睾吸虫囊蚴脱囊的超微结构进行观察和分析。方法取华支睾吸虫阳性麦穗鱼,去除头、鱼鳞和内脏,称重后绞碎,按1 g∶10 ml比例加入人工消化液(成分为0.6 g胃蛋白酶,100 ml生理盐水,1 ml浓盐酸),于37℃消化过夜后反复过滤,体视显微镜下分离成熟囊蚴。加入0.025%胰蛋白酶溶液(pH=7.4),37℃孵育约3 min,将脱囊后尾蚴、未完全脱出后尾蚴、外形较完整囊蚴及脱下空囊分开收集,使用3%戊二醛与1%四氧化锇固定制样。样品使用50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐级浸泡脱水(每级10 min,100%乙醇脱水重复3次),100%六甲基二硅烷浸泡3次(每次10 min),干燥后镀膜喷金,使用扫描电子显微镜观察样品;按50%、70%、90%乙醇、1∶1混合液(90%乙醇∶90%丙酮)、90%、100%丙酮逐级脱水(每级10 min,100%丙酮脱水重复3次),依次于丙酮与包埋剂(环氧树脂618)1∶1、1∶3混合液与全包埋剂中浸泡后聚合处理,修块、切片、醋酸铀⁃柠檬酸铅双重染色,使用透射电子显微镜观察样品。结果扫描电镜下可见囊蚴外观出现了局部膨胀或凹陷、褶皱及塌陷、囊壁内外层分离;脱囊形成的线状裂口长、边缘平整,未能脱出的后尾蚴被软塌的囊壁包裹,其上皮棘刺穿囊壁;脱囊后尾蚴背、腹面遍布体棘,腹吸盘明显大于口吸盘,口、腹吸盘内壁结构不同;排泄囊内填满大小不一圆球形排泄颗粒。透射电镜下显示,脱囊后尾蚴体壁为合胞体结构,由外向内可见皮层外质膜下为电子致密的颗粒状基质,基质向表面形成突起,基质内含许多分泌颗粒及大小不等囊泡;皮棘根部从基质膜发出,穿过基质从皮层表面穿出;基层厚度差异较大,内含多个高电子密度分泌小体;外环肌和内纵肌发达,深入到细胞层,经胞质管运送的物质在远端形成囊泡;皮层细胞间物质发达,充满杂乱分布的管状、大小不等的囊泡结构及线粒体。结论囊蚴凭借发达的肌肉组织剧烈运动,在脱囊中起积极作用;皮棘有助于后尾蚴尽快摆脱软化囊壁的包裹;囊内后尾蚴可能借助运动触碰囊壁方式使皮层分泌物可直接作用于内壁,发挥化学性软化内壁作用来协助脱囊。