肿瘤细胞原位重编程为抗原呈递细胞的策略

免疫逃逸是肿瘤的基本特征之一,而免疫疗法近年来在肿瘤治疗中取得了巨大成功。这些疗法包括免疫检查点抑制剂、过继性细胞疗法[如嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)]、癌症疫苗、溶瘤病毒等。细胞疗法在多种血液肿瘤中疗效显著,但在实体肿瘤的治疗中效果并不理想,主要原因是回输的免疫细胞难以充分浸润到肿瘤部位。为解决这一难题,研究者尝试将肿瘤组织内的癌细胞原位重编程为免疫细胞,从而充分激活抗肿瘤免疫反应并克服以往细胞治疗依赖体外细胞扩增的局限,同时具有免疫排斥反应弱的优点。目前,肿瘤原位重编程的目标细胞包括巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞(DC)和T细胞等,其中树突状细胞作为经典抗原呈递细胞(APC)在启动免疫反应中发挥核心作用,是增强抗肿瘤免疫应答的关键效应细胞。迄今有两种原位重编程的方法,即基于转录因子异位表达及共刺激信号分子和细胞因子共表达策略,均显示出较强的转化应用前景。

三带双锯鱼(Amphiprion ocellaris)烟碱型乙酰胆碱受体基因的克隆及生物信息学分析

鱼类的许多生理过程都受到烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors)的调节,如神经肌肉信号传递。在海洋环境中,三带双锯鱼(Amphiprion ocellaris)被芋螺(Conus)捕食的过程与烟碱型乙酰胆碱受体密切相关。本研究以三带双锯鱼肌肉、脑、肠道组织的cDNA作为模板,克隆三带双锯鱼烟碱型乙酰胆碱受体不同亚基的基因,在此基础上进行生物信息学分析,同时构建系统进化树。研究结果表明,从三带双锯鱼肌肉组织中克隆得到了烟碱型胆碱能受体α1亚基(cholinergic receptor nicotinic alpha1 subunit,chrna1)和烟碱型胆碱能受体ε亚基(cholinergic receptor nicotinic epsilon subunit,chrne)基因序列;从脑组织中克隆获得烟碱型胆碱能受体α10亚基(cholinergic receptor nicotinic alpha10 subunit,chrna10)基因序列。将得到的基因序列利用Colabfold软件对其编码蛋白的3D结构进行预测,所得结果与已经解析的烟碱型乙酰胆碱受体的结构高度相似。采用荧光定量PCR技术对chrna1、chrne、chrna10基因在三带双锯鱼肌肉、脑、肠组织中的表达水平进行检测,结果显示,chrna1、chrne基因在肌肉组织中的表达量非常高,在脑组织中的表达量非常低,肠道组织中没有检测到表达。chrna10基因在脑组织中的表达量较低,在肌肉、肠道组织中没有检测到表达。系统进化树结果表明不同物种间乙酰胆碱受体的蛋白序列高度保守,三带双锯鱼与模式生物斑马鱼(Danio rerio)几乎同源。

α7烟碱型乙酰胆碱受体分子伴侣Tmem35a的克隆及其功能研究

烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)属于配体门控离子通道受体,其中α7nAChR亚型广泛分布于大脑皮层、丘脑和海马体等区域。此外,在小胶质细胞、巨噬细胞、骨髓细胞等也有分布,研究发现其与胆碱能抗炎通路的功能密切相关,是阿尔茨海默症和精神分裂症药物开发的重要靶标。建立稳定的体外药物筛选体系,对于靶向α7 nAChR新药的高效筛选至关重要。在非洲爪蟾卵母细胞膜上,重组表达nAChRs的不同亚型,并通过电生理技术进行电流检测,是一种先进而复杂的新药筛选模型。分子伴侣可以协助部分nAChRs亚基组装形成功能性受体,为靶向该受体的化合物筛选提供稳定表达的模型。为此,本研究从大鼠体内分离克隆了α7 nAChR的一个分子伴侣基因,其名称为Tmem35a(transmembrane protein 35A),进一步构建了该基因的重组表达载体,再利用体外转录技术获得了该基因的cRNA,将之与α7 nAChR的cRNA混合后同时注射到非洲爪蟾卵母细胞中进行表达。然后,利用双电极电压钳检测该分子伴侣对α7 nAChR电流表达和通道药理活性的影响。结果显示,TMEM35A(也被称为novel acetylcholine receptor chaperone,NACHO)可有效提高α7 nAChR蛋白在卵母细胞膜上的表达,受体蛋白表达量提高了约1倍;其配体乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)刺激诱发的峰值电流提高了约10倍。注入Tmem35a cRNA后的卵母细胞,其表达的α7 nAChR对激动剂ACh的半数效应浓度为228.5μmol·L^(-1),和本体223.3μmol·L^(-1)基本一致,维持了α7受体正常功能特性。研究结果表明,分子伴侣NACHO有效协助了α7 nAChR在非洲爪蟾卵母细胞的异源表达,稳定表达的α7 nAChR可以为靶向该受体的先导化合物活性筛选提供模型。本研究所有动物实验过程经广西大学伦理委员会审查批准(批准号:GXU-2023-0249)。

非洲爪蟾卵母细胞表达系统中N-型电压门控钙离子通道新药筛选模型的建立与优化

N-型电压门控钙离子(Ca^(2+))通道(N-type voltage-gated calcium channel,N-type VGCC,Ca_(V)2.2)在突触前末端响应动作电位介导Ca^(2+)内流,并在突触发生、神经递质释放和伤害性信号传递中发挥重要作用,是神经痛(慢性痛)等重大疾病治疗药物研发的关键靶点。由于钙离子通道体外表达困难,通道电流检测技术复杂,其新药筛选模型极其缺乏。因此,本研究利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统,进行Ca_(V)2.2体外重组表达,建立电生理学技术药物筛选模型,并对该表达技术体系进行了优化(本研究获得广西大学伦理委员会审查批准,批准号:GXU-2023-0249)。首先,以大鼠Ca_(V)2.2的主亚基α1B及其辅助亚基α2δ1和β3的cDNA基因为模板,分别在体外进行转录,人工合成了Ca_(V)2.23个亚基的mRNA(cRNA),按照2∶1∶1的质量比混合,将3种cRNA注射到非洲爪蟾卵母细胞中进行表达。随后使用双电极电压钳技术检测Ca_(V)2.2离子通道是否产生细胞膜内向电流,同时对各个表达条件进行了优化,从通道的激活、失活等方面表征了其门控功能。结果显示,在cRNA显微注射后的第3~5天,使用四乙基氢氧化铵(TEAOH)和1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四酯(BAPTA-AM)处理,可分别消除内源性钾离子通道和Ca^(2+)激活的氯离子通道干扰,成功检测到稳定的Ca_(V)2.2介导的钡离子电流。Ca_(V)2.2的最大激活膜电位为0 mV,当膜电位大于+50 mV时会出现电流方向反转。通过拟合稳态激活和失活曲线获知Ca_(V)2.2的半激活电位和半失活电位分别为-15.9和-60.2 mV。本研究基于非洲爪蟾卵母细胞,通过条件优化,建立了稳定的Ca_(V)2.2表达系统。该体外表达系统可以为靶向Ca_(V)2.2活性化合物或先导药物的筛选提供新的途径。