基于易错PCR技术的黏质沙雷氏菌脂肪酶基因LipA的定向进化

利用易错PCR技术对黏质沙雷氏菌脂肪酶基因LipA进行定向进化,经过筛选最终获得一个比活力比野生酶提高了425 U/mg的突变体ep1,测序分析ep1有5个氨基酸发生了突变,与野生酶相比ep1的最适pH值由原来的8.5降低为7.5,Tm值提高3℃,Km值由原来的40 mg/mL降低为12.5 mg/mL。对其三维结构进行分析,推测酶学性质的改变可能与处在活性中心右前方双螺旋发卡结构上的I58A、和处在下部β卷曲折叠拐角处的S375G的突变有关。

CO2-高温液态水体系下果糖分解制备5-羟甲基糠醛的研究

5-羟甲基糠醛(5-HMF)是一种重要的化工中间体,具有非常广泛的应用价值和市场前景。在CO2-高温液态水体系下,探讨了二氧化碳初始压力、反应温度以及果糖初始浓度等因素对果糖制备5-HMF的影响。结果表明,CO2-高温液态水催化体系对果糖脱水分解制备5-HMF具有较高的催化活性,在果糖初始浓度高达10%时也可获得较好的5-HMF收率。在果糖浓度为3%,CO2压力为5.0 MPa,160℃的条件下反应100 min,5-HMF的收率为54.3%,反应生成5-HMF的选择性高达57.7%,催化活性为无CO2的高温液态水的2～3倍。CO2压力对果糖分解制备5-HMF有重要影响,随着体系中CO2压力的增加,5-HMF的收率也逐渐增加,但生成5-HMF的选择性有所下降。

熵最小算法解析中药挥发油GC-MS谱中同分异构体的研究

采用以熵最小算法为基本原理的化学计量学方法,结合气相色谱-质谱联用分析法,对玫瑰精油及茉莉花挥发油中的2对同分异构体重叠峰进行重建分析,并分别得到各组分的重建质谱,同时采用NIST数据库相似度检索、质谱碎片信息比对及程序升温指数对分析得到的各组分进行定性分析。通过分析,分别从玫瑰精油和茉莉花挥发油的GC-MS重叠峰中分离得到1对同分异构体。分析结果显示,采用熵最小算法可以成功地对重叠峰中的各组分进行定性分析。该研究为类似同分异构体混合物中各组分的测定提供了参考。

广西南宁发展燃料乙醇与节能减排的关系

根据生命周期评价,对燃料乙醇的节能和减排效果进行分析,依据发展规划,得出广西南宁发展燃料乙醇对节能减排的影响。结果表明,发展燃料乙醇将在节能和减排方面均产生积极作用,应加大在南宁乃至广西发展非粮燃料乙醇产业的力度。

产异丁醇大肠杆菌工程菌的构建

酮酸脱羧酶是异丁醇生物合成的关键酶,而大肠杆菌中没有此基因。将乳脂乳球菌NIZO B1157的2-酮酸脱羧酶基因kdcA克隆到非生产菌株大肠杆菌中,同时串联表达与前体物质酮酸相关的alsS、ilvC和ilvD基因,构建了串联表达质粒pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA。大肠杆菌工程菌成功表达了4个基因,并能利用葡萄糖发酵产异丁醇,发酵24 h后最高产量为3 g/L。

甘蔗糖蜜酒精高产酵母的发酵特性研究

采用20L三联装发酵罐进行甘蔗糖蜜高浓度酒精发酵研究高产酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MF1001菌株的甘蔗糖蜜酒精发酵特性。结果表明,锤度为20°Bx的糖蜜对菌株生长和发酵均没影响,发酵的适宜温度为30℃,pH值4.0的发酵效果明显优于pH值3.80,传代培养16代及不同的接种量对菌株的发酵没有影响。按目前甘蔗糖蜜酒精生产的发酵工艺,用锤度为20°Bx糖蜜培养基培养菌株,制备种子液,然后将种子液与锤度为55°Bx的糖蜜培养基1∶1混合进行发酵,发酵50h的醪液酒精含量达到了13.2%(V/V),60h达13.8%(V/V),72h达14.3%(V/V)。发酵结束时醪液可发酵残糖含量低至0.44%,发酵效率分别为理论值88.6%(50h)、94.3%(60h)和98.6%(72h)。该菌株有望用于甘蔗糖蜜酒精发酵生产,提高甘蔗糖蜜酒精发酵的醪液酒精含量。

甘蔗糖蜜发酵生产L-乳酸工艺条件研究

以甘蔗糖蜜作为原料,利用经诱变筛选得到的鼠李糖乳杆菌SCT-10-10-60发酵生产L-乳酸。通过设置单因素实验,研究不同初始糖蜜浓度(50%、40%、30%、20%)、不同发酵温度(30℃、37℃、42℃、47℃)、不同pH调节剂碳酸钙加入量(4%、6%、8%、10%)和氮源替代(尿素替代酵母粉)对L-乳酸产量的影响。结果表明,在初始糖蜜浓度20%(m/V)、温度37℃、碳酸钙浓度4%(m/V)、鼠李糖乳杆菌SCT-10-10-60接种量6%(V/V)的发酵条件下,发酵40h L-乳酸的产量最高可以达到106g/L。尿素不能作为菌株生长所需要的氮源。

瑞氏木霉内切-β-1,4葡聚糖酶基因Egl1的分子改造

为了提高瑞氏木霉（Trichoderma reesei）的纤维素酶活力,用分子改造的方法改造其内切-β-1,4葡聚糖酶基因Egl1。用DNaseⅠ消化Egl1,回收50~200bp的片段,用T4 DNA连接酶连接回收的片段,进行PCR反应,将PCR产物转入瑞氏木霉原生质体,用比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力提高的菌株。结果筛选到2株滤纸酶活力比出发菌株提高的菌株Egl36-4和Egl33-4B2Z2,其酶活力分别比出发菌株提高了2.8倍和3.6倍。

固定化粘质沙雷氏菌脂肪酶催化制备脂肪酸甲酯

将实验室构建的产粘质沙雷氏菌脂肪酶的基因工程菌于20 L发酵罐中发酵,并将分离提取获得的粗脂肪酶液用sol-gel包埋法和大孔吸附树脂吸附两种方法进行固定化,考察了醇油比、含水量、反应温度、反应时间、催化剂用量对生物柴油产率的影响。实验结果显示采用大孔树脂吸附法制备的固定化酶的催化效果优于sol-gel包埋法制备的固定化酶,在优化条件下,以大孔树脂吸附法制备的固定化酶可使生物柴油的单批转化率达到88%。

基因astE调控微生物抵御丁醇胁迫的生理机制解析

探究敲除精氨酸代谢途径关键酶ast E对大肠杆菌抵御丁醇胁迫能力的影响。借助氨基酸分析仪全面分析ast E基因敲除对细胞内外游离氨基酸水平的变化。同时,通过测定ast E缺失突变株抵御丁醇和酸胁迫的能力,并分析两者之间的联系。研究表明:与对照菌株BW25113相比,突变株△ast E抵御丁醇胁迫和酸胁迫的能力显著提高,分别提高了30%(8 g/L丁醇)和54.5%(p H 3.0)。同时,通过胞内外氨基酸分析发现,高浓度丁醇胁迫可抑制BW25113和△ast E合成谷氨酸的能力,使其浓度分别降低73.6%和89.1%。在此基础上,外源添加精氨酸实验表明:适量精氨酸能有效提高细胞抵御高浓度丁醇胁迫的能力。敲除精氨酸代谢途径关键酶ast E可显著提高大肠杆菌抵御丁醇胁迫的能力,且其调控机制与耐酸胁迫密切相关。

重组鼠李糖乳杆菌发酵L-乳酸的初步研究

将自杀质粒pDT转化到鼠李糖乳杆菌JCM1553中,成功获得了具有四环素抗性的鼠李糖乳杆菌。生长曲线说明,重组菌株能在5μg/mL四环素MRS培养基中正常生长,最适培养温度为37～42℃。重组菌株在含有10%、15%、20%、25%的葡萄糖发酵培养基中的发酵结果显示:37℃,200 r/min发酵40～88 h,菌体密度OD600最大为29.05;残糖含量最低为0.604%,L-乳酸的最大产量为228.19 g/L,葡萄糖转化率最大为96.24%。

应用合成生物学策略构建全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻

目的:在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶(DAR),同时构建辅酶NADH原位再生系统,利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻。方法:PCR克隆多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) dar基因连到质粒pETDuet-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR;通过Hi Trap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白,测定DAR的比酶活和分子动力学参数。在重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统,协同表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(GDH),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH,并以此重组菌为全细胞生物催化剂,优化催化条件,提高(S)-乙偶姻的产量和产率。结果:获得重组工程菌E. coli BL21(DE3)-DAR和E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2. 59mmol/L、1. 64μmol/(L·min·mg)、12. 3/s,还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95. 86%,具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶NADH原位再生系统后,重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料,乙偶姻产量达51. 26g/L,转化率为81. 37%,生产速率为5. 13g/(L·h)。结论:使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻,以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻,不需额外添加昂贵的辅酶,具有较高的生产应用价值。

三株甘蔗糖蜜酒精发酵高产酵母菌株的筛选

从甘蔗糖厂的废弃物中筛选到3株甘蔗糖蜜酒精发酵高产菌株MF1001、MF1002和MF1003,经rDNAITS序列同源比对鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的不同菌株。3个菌株均可以完全利用葡萄糖和蔗糖,部分利用棉子糖和半乳糖,均不能利用乳糖和木糖。MF1001发酵甘蔗糖蜜的残糖含量明显低于目前使用的生产菌株,略低于标准测定菌株CICC31149和CICC31279,MF1002和MF1003的残糖含量略低于目前使用的生产菌株。与生产菌株相比,3个菌株在甘蔗糖蜜的生长速率略低,但是维持高菌数的时间较长。按目前甘蔗糖蜜酒精生产的发酵工艺,3个菌株30℃发酵72h的醪液酒精含量分别为14.26%（V/V）、14.48%（V/V）和13.50%（V/V）,比目前生产使用的菌株高19.5%-28.6%;37℃发酵40h的醪液酒精含量分别为12.03%（V/V）、12.06%（V/V）和12.14%（V/V）,比目前生产使用的菌株高10.0%~11.7%。这3个菌株具有提高甘蔗糖蜜发酵醪液酒精含量的潜在工业价值。

响应面优化木糖母液发酵产丁二酸

对产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)GXAS137发酵木糖母液产丁二酸的条件进行优化,探索利用废弃木糖母液合成高附加值丁二酸的可行性。首先通过Plackett-Burman实验设计确定影响丁二酸发酵的显著因子,然后采用最陡爬坡实验逼近各显著因子的最优区域,最后通过Box-Behnken实验设计确定各因子的最优水平。影响木糖母液发酵产丁二酸的显著因子及最优浓度分别为:木糖母液64.75g/L,玉米浆15.71g/L,碱式碳酸镁46.39g/L。在最优发酵培养条件下,丁二酸产量达到38.01g/L,比优化前提高了20.7%,与模型预测值(38.41g/L)基本一致。进一步利用2L发酵罐进行了放大试验,发酵72h丁二酸产量最高可达48.99g/L,较厌氧瓶发酵提高了28.9%,丁二酸得率为0.80g/g总糖。结果表明,采用低价的木糖母液作为底物,可为未来低成本、高效产业化生产丁二酸奠定坚实的基础。

添加适量菌棒废渣提高桑枝颗粒燃料成型率及改善燃烧性能

对桑枝（ramulus Mori,RM）和菌棒废渣（mushroom-planted residue,MPR）进行了工业分析、元素分析、生物质三组分以及空气干燥基低位发热量值分析。从RM和MPR中分别提取了木质素,通过DSC测定了其玻璃化转变温度。结果表明RM的挥发分含量、低位发热量值和玻璃化转变温度较高,分别为72.54%,17.57 MJ/kg和160.6℃;MPR的挥发分含量、低位发热量值和玻璃化转变温度分别为66.72%、15.23 MJ/kg和136.8℃,通过单因素方差分析表明其与RM存在极显著差异。该研究通过在RM中分别添加5%~20%质量分数的MPR作为黏结剂,采用4 mm孔径振动筛控制颗粒度,在含水率为20%±0.5%以及可变的环模孔长孔长径比条件下,通过压辊环模成型机制备了RM/MPR复合颗粒燃料。结果表明在环模孔长径比为4：1时,RM不能有效的致密化,颗粒成型率仅为50.24%。MPR具有更好的流动性和黏结性,可作为黏结剂将RM纤维粘结于一起,增加一定质量比例的MPR可以提高RM颗粒成型率。在环模孔长径比为4：1时,随着MPR的添加量增加至10%~15%,RM/MPR复合颗粒燃料的成型率大于91.54%。在MPR的添加量在5%~20%范围内,RM/MPR复合颗粒燃料的密度、耐久率以及燃烧值分别高于1.208,96.42%和17.26 MJ/kg,符合生物质燃料要求。

钴锌双金属氰化物/戊二酸锌复合催化剂催化CO_2与环氧丙烷的共聚反应

制备了钴锌双金属氰化物/戊二酸锌(DMC-P123/ZnGA)复合催化剂并用于催化CO2与环氧丙烷(PO)共聚反应。采用热重分析、X射线衍射和扫描电镜对催化剂进行了表征。结果表明,DMC-P123以更小粒径均匀分散到ZnGA中;该催化剂对于CO2与PO共聚反应有较高的催化效率,并得到高相对分子质量的聚碳酸亚丙酯(PPC);当反应温度为60℃,反应时间为12 h时,催化效率大于550 g聚合物/g催化剂,PO的转化率达到94%;所得共聚产物的数均相对分子质量达到6万,碳酸酯链节含量大于68%,CO2固定率达到30%。

硅烷化改性木薯淀粉/聚碳酸亚丙酯共混膜的结构及耐水性

以三甲基氯硅烷(TMCS)对木薯淀粉进行疏水化处理,并通过热压混合法制备了硅烷化改性木薯淀粉/聚碳酸亚丙酯(TMCS-Starch/PPC)共混膜。采用傅里叶变换红外光谱、X射线衍射以及扫描电子显微镜对共混膜进行表征。结果表明,三甲基氯硅烷基团被成功引入到木薯淀粉颗粒表面;热压成型后TMCS-Starch由结晶态转变为无定形态,并与PPC具有明显的氢键作用。研究了共混膜的力学性能和耐水性。结果表明PPC可以明显改善共混膜的韧性和耐水性能,当TMCS-Starch与PPC的质量比为3/7时,共混膜的断裂伸长率达到601.2%,吸水率和淀粉溶出率分别较TMCS-Starch膜降低了17.15%和85.29%。

负载型磷钨酸催化剂的制备及其催化果糖分解制备5-羟甲基糠醛的研究

以MCM-41、HZSM-5以及丝光沸石(MOR)为载体,磷钨酸(PW)为活性组分,通过浸渍法制备一系列负载型磷钨酸催化剂;采用FTIR、XRD、N2-吸附-脱附和NH3程序升温脱附等分析手段对催化剂进行表征.结果表明在负载活性物质过程中,载体骨架未被破坏,PW以无定形结构均匀分散到载体的表面并与载体间存在着明显的键合作用.通过果糖分解制备5-羟甲基糠醛(5-HMF)的反应对催化剂的催化性能进行了评估,结果表明相对于其它催化剂,HZSM-5负载磷钨酸催化剂(PW/HZSM-5)凭借其具有更高的表面酸量以及合适孔径而表现出更好的催化活性和更高选择性的生成5-HMF;以二甲基亚砜为溶剂,PW/HZSM-5为催化剂,在120℃条件下反应80min,果糖的转化率高达到96.5%,生成5-HMF的选择性为79.9%.

丙酮丁醇梭菌发酵糖蜜生产丁醇的发酵条件优化

运用单因素试验结合正交设计法优化丙酮丁醇梭菌发酵甘蔗糖蜜生产丁醇的发酵条件,并进行验证试验。得到发酵条件的最优组合为(NH4)2HPO4的添加量为0.3%,H2NCONH2的添加量为0.1%、Na2HPO4的添加量为0.5%,KH2PO4的添加量为0.5%,L-半胱氨酸盐酸盐-水物的添加量为0.025%,蛋白胨的添加量为0.9%,NaH2PO4的添加量为0.1%,优化后发酵的丁醇产量为11.0536g/L,比原始菌株提高了23.58%。这对糖蜜多途径综合利用有一定的推动作用。

甘蔗糖蜜酒精高产酵母菌株MF1001的高浓发酵生产试验

以甘蔗糖蜜酒精高产菌株MF1001为生产菌株,采用双流加酸性连续发酵工艺进行工业化高浓度甘蔗糖蜜酒精发酵生产试验,连续发酵15d。发酵生产线共9个发酵罐,发酵温度由1～4号罐的内置式盘管循环水控制,依次为30～32℃(1号罐)、34～36℃(2号、3号罐)、30～32℃(4号罐)、(33～35)℃(5号、6号罐)、(34～36)℃(7～9号罐),物料流量由计量泵控制为68m3/h。低、高浓料的pH值分别控制在3.6～3.8和3.8～4.0,糖蜜锤度分别控制为20°Bx和40～47°Bx。结果表明,发酵49.5h的成熟醪酒精班产浓度最高达到14.1%(V/V),日产平均浓度最高达到13.8%(V/V),发酵效率按糖蜜可发酵糖含量计算最高达到理论值的98.89%,平均为97.72%,每生产1t酒精(95%,m/V)的发酵废液排放量最低为7.57t,平均为8.17t,各项工艺指标均显著优于国内目前的发酵水平。