褪黑素与盐酸多巴胺在猪精液冷冻保存中的应用效果

为给改良猪精液冷冻稀释液配方提供参考数据,分析了不同浓度褪黑素和盐酸多巴胺对猪精子冷冻后畸形率和顶体完整率的影响。结果表明,10mmol/L褪黑素及3种浓度的盐酸多巴胺(0.1mmol/L,1mmol/L,10mmol/L)均能有效改善冻后猪精子的畸形率和顶体完整率,两种试剂均可在猪精液冷冻中进一步推广应用。

抗凋亡药物在精液保存中的应用研究进展

抗凋亡药物的研究无论在疾病治疗还是在抗毒、抗衰老方面都有十分重要的意义。在简述近年来抗凋亡药物在医学领域研究概况的基础上,重点综述了其在动物和人精液保存中的研究进展。

3种抗凋亡试剂在猪精液常温保存中的应用效果

将抗凋亡试剂葛根素(0、0.02、0.10、0.50、2.50 mmol/L)、酒石酸美托洛尔(0、0.02、0.10、0.50、2.50 mmol/L)、二氯乙酸钠(0、0.04、0.20、1.00、5.00 mmol/L)加入稀释液中,探讨它们在猪精液常温保存中的效果。结果表明:0.50 mmol/L葛根素可以延长精子保存时间及存活指数(P<0.05);0.50 mmol/L酒石酸美托洛尔能降低精子畸形率(P<0.05);5.00 mmol/L二氯乙酸钠可以缩短精子存活时间和存活指数(P<0.05)。总之,合适浓度的葛根素或酒石酸美托洛尔可以显著提高猪精液常温保存后的品质,而二氯乙酸钠对猪精液常温保存效果没有明显的改善作用。

PTD-FNK蛋白对猪精子的冷冻保护作用及其机制

为评估PTD-FNK蛋白对猪精子冻后质量的影响,以探讨其可能的作用机制。在猪精液冷冻稀释液中添加不同浓度(0、0.1、1、10、100nmol/L)的PTD-FNK蛋白,采用精子图像分析仪分析冻后猪精子的质量,使用流式细胞仪检测冻后精子AnnexinV-FITC/PI染色后的凋亡情况,利用相对荧光定量PCR和多功能酶标仪检测不同凋亡途径中精子相关基因的表达量变化或含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)的活性和染色后线粒体mPTP开放性。结果表明,与对照组相比,10nmol/LPTD-FNK蛋白试验组猪精子冻后活性、活率和顶体完整率均显著升高(P<0.05,P<0.01),凋亡率和Bax、caspase-3、caspase-9基因表达量、caspase-9蛋白酶活性、mPTP开放性均显著降低(P<0.05)。说明PTD-FNK可能通过线粒体内源性凋亡途径抑制冻融猪精子的凋亡。

基于iTRAQ技术的猪精子释放蛋白Transwell小室分离及差异性分析

【目的】探索分离猪附睾头部精子释放蛋白的新方法,确定释放蛋白的功能特点及信号通路。【方法】利用Transwell小室独特的共培养系统,充分利用0.4μm聚碳酸酯膜分离精子释放的蛋白。使用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术分析释放的蛋白,对鉴定到的差异蛋白,使用GO数据库描述蛋白功能,运用KEGG数据库Pathway分析,确定差异蛋白最主要的生化代谢途径和信号转导途径,同时用IPR数据库对差异蛋白的结构域进行非冗余分析。【结果】Transwell小室上、下室共鉴定到542种蛋白,其中,464种蛋白表达量显著上调,78种蛋白表达量显著下调。差异蛋白主要参与跨膜转运、离子运输、ATP合成等生物过程。差异蛋白主要参与的信号通路为醛固酮调节的钠盐吸收、囊泡转运、EGFR酪氨酸激酶抑制等。硫氧还蛋白、半乳糖、糖苷水解酶等构成差异蛋白的主要结构域,为蛋白发挥作用提供结构基础。【结论】Transwell小室分离蛋白的方法切实有效,iTRAQ技术在附睾头部精子释放蛋白中成功鉴定出差异蛋白,差异性分析及功能注释为探究差异蛋白参与的生命活动及功能奠定了基础。

中药提取物川芎嗪及葛根素在猪精液冷冻中的应用效果初报

为了进一步提高猪精液的冻后品质,为中药提取物在猪精液冷冻中的应用提供参考数据,采用手握法采集成年种公猪精液,预处理后用添加不同剂量盐酸川穹嗪(0、0.08、0.10、0.12 mmol/L)和葛根素(0、0.001、0.01、0.10 mmol/L)的稀释液稀释,经平衡、冷冻、解冻后采用考马斯亮蓝对精子进行染色,然后在显微镜下检查精子畸形率和顶体完整率。结果表明,不同浓度的盐酸川穹嗪均能显著降低冻后精子的畸形率,显著提高冻后精子的顶体完整率,其中0.12 mmol/L盐酸川穹嗪效果最好。一定量葛根素不能显著降低冻后精子的畸形率,也不能显著提高冻后精子的顶体完整率。

水蛭素对冷冻前后猪精液中超氧化物歧化酶活性及mRNA表达的影响

课题组前期试验表明,0.08%水蛭素能够显著提高冻后猪精液质量。为研究其作用机理,用含不同浓度(0、0.04%、0.08%、0.12%)水蛭素的稀释液稀释美系长白公猪精液,分别检测平衡后及冻融后精液中超氧化物歧化酶的活性和mRNA表达量的变化。结果表明:(1)不含水蛭素的冷冻稀释液显著降低新鲜猪精液超氧化物歧化酶活性(P<0.05),而含有0.08%水蛭素的冷冻稀释液处理的猪精液超氧化物歧化酶活性分别在平衡组与冷冻组最高(P>0.05);(2)含有0.08%水蛭素的猪精液平衡及冻融后的超氧化物歧化酶mRNA表达量最高,但差异不显著(P>0.05)。总之,添加0.08%水蛭素对冷冻前后猪精液超氧化物歧化酶活性及mRNA表达无显著影响。

猪PFKL基因克隆及生物信息学分析

试验旨在探究猪精液6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase,PFKL)基因的理化性质和结构特点,以期阐明糖酵解在精子发生过程中的生理作用及调控机制。通过RT-PCR技术扩增PFKL基因,将获得的基因片段插入到pUC57载体上进行克隆测序,并结合生物信息学方法预测和分析其氨基酸序列、跨膜结构、修饰位点、二级结构、三级结构、抗原位点、功能注释等。结果表明,PFKL基因全长2349 bp,编码782个氨基酸,蛋白质分子质量为83.819 ku,等电点为6.96,为酸性蛋白质,分子式为C3674H5897 N1051O1109S40。猪源PFKL基因与鼠、鸭、羊、牛、猩猩、人的参考序列同源性均高达80.0%以上。该蛋白不存在跨膜结构和信号肽区域,含有2个N-糖基化修饰位点、14个O-糖基化位点、35个磷酸化位点。PFKL蛋白三维建模结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成,与肌肉型磷酸果糖激酶和血小板型磷酸果糖激酶的同源性分别为68.24%和70.84%。PFKL基因含有的27个抗原位点强弱不同,柔韧性分布较均匀,有较高的表面可塑性,且存在PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,为具有较多潜在B细胞抗原表位的亲水性蛋白。GO功能注释分析结果表明,PFKL基因具有碳水化合物激酶活性、磷酸果糖激酶活性,能够参与己糖代谢和单糖代谢。本研究结果为改善精子品质和提高精卵结合发生率奠定了分子生物学基础。

他克林对猪精子冻后质量、抗氧化能力及糖代谢的影响

旨在研究他克林对猪精液冻后质量、抗氧化能力及糖代谢的影响机制。手握法采集12头18~24月龄健康杜洛克种公猪精液,在其冷冻保存稀释液中加0.10 mmol/L他克林并冷冻保存,检测冻后精子活率、质膜完整率、顶体完整率和畸形率、线粒体膜电位、DNA完整性,同时利用试剂盒检测总抗氧能力、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、总胆固醇含量、丙酮酸含量及己糖激酶活性。结果表明,与鲜精相比,冻融后精子活率和质膜完整率、顶体完整率、线粒体膜电位、DNA完整性、抗氧化能力及糖代谢指标均极显著下降,畸形率极显著升高。与空白组相比,他克林显著提高冻后精子顶体完整率、DNA完整率、超氧化物歧化酶、丙酮酸含量;极显著提高精子活率、质膜完整率、线粒体膜电位、总抗氧能力、丙二醛含量、总胆固醇含量及己糖激酶活性,极显著降低畸形率。总之,猪精液冷冻前添加浓度为0.10 mmol/L的他克林可能通过提高抗氧化能力和糖代谢水平改善冻融后猪精子的质量。

黄芪多糖对冷冻前后猪精液中过氧化氢酶活性及其mRNA表达的影响

为了研究黄芪多糖对猪精液冷冻前后过氧化氢酶(CAT)活性及其mRNA表达的影响,用含不同质量浓度(0、0.2、0.4、0.6g/L)黄芪多糖的稀释液稀释美系长白公猪精液,用0.5mL细管分装冷冻,分别检测平衡后及冻融后精液中CAT活性和mRNA表达量的变化。结果显示,0.4g/L黄芪多糖能显著提高冷冻保存的猪精液中CAT活性及平衡后CAT mRNA表达(P<0.05),同时冻融后CAT mRNA表达在冷冻组中最高(P>0.05)。结果表明,冷冻前后猪精液中CAT活性及平衡后CAT mRNA表达的显著提高是黄芪多糖改善猪精液冻后质量的主要原因之一。

盐酸川穹嗪在猪精液液态保存中的应用

为了探讨抗凋亡药物盐酸川穹嗪在猪精液常温（16—18℃）与低温（0～5℃）保存中的应用效果，试验将不同浓度的盐酸川穹嗪（0，0．08，0．80，8．00mmolfL）分别加入猪精液常温或低温保存稀释液中，即对照组、试验1组、试验2组、试验3组，比较2种保存条件下精子的稀释后活力、有效存活时间、总存活时间及存活指数。结果表明：在常温保存条件下，各组精子稀释后活力差异不显著（P〉0．05），试验1组可以极显著（P〈0．01）延长精子的有效存活时间、总存活时间并提高存活指数，但随着浓度的升高，3个指标有降低的趋势；在低温保存条件下，各组精子稀释后活力及存活指数差异不显著（P〉0．05），试验组的总存活时间显著长于对照组（P〈0．05），但在有效存活时间方面仅试验1组与对照组相比差异显著（P〈0．05）。说明低浓度的盐酸川穹嗪可以更有效地维持精子存活，0．08mmol／L是盐酸川穹嗪在猪精液常温或低温保存时的最佳添加浓度。

褪黑素及多巴胺对猪精液液态保存效果的影响

为了探讨2种抗氧化剂在猪精液液态保存中的效果,将褪黑素(0、0.001、0.01、0.1 mmol/L)、多巴胺(0、1、10、100 mmol/L)加入稀释液中,对猪精液进行常温及低温保存。结果表明:常温保存时各褪黑素实验组稀释后活力或0.1 mmol/L组有效存活时间与对照组无显著差异(P>0.05),其他指标、各实验组均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)好于对照组;低温保存时褪黑素各组稀释后活力或存活指数之间、0.001 mmol/L和0.1 mmol/L组有效存活时间与对照组之间没有显著差异(P>0.05),0.01 mmol/L组有效存活时间和各实验组总存活时间显著好于对照组(P<0.05);1 mmol/L多巴胺组常温保存存活指数和低温保存总存活时间显著好于对照组(P<0.05),其他指标或另2个实验组所有指标与对照组差异不显著(P>0.05),100 mmol/L多巴胺组常温保存下各指标显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差于对照组。总之,合适浓度的褪黑素可以提高猪精液液态保存后的品质;低浓度的多巴胺更有利于猪精子的液态保存,但其适宜的低温保存添加浓度有待探讨。

金雀异黄酮对猪精子冻后质量及获能状态的影响

分别在精液冷冻稀释液中添加不同浓度(0,25,50,75,100μmol/L)的金雀异黄酮,按照不同时间(30,60,90 min)孵育后冷冻。解冻后检测精子活力、顶体完整率和质膜完整性等表观指标;分光光度计检测各组Ca^2+浓度,金霉素染色检测精子获能状态。结果显示,当精液冷冻液中添加100μmol/L的金雀异黄酮孵育60 min后冷冻,解冻后精子活力提高,与对照组相比差异极显著(P<0.01),顶体完整率和质膜完整性略高于空白对照组;Ca^2+浓度低于其他处理组;B型精子数降低,与对照组相比差异显著(P<0.05)。综上所述,金雀异黄酮能够通过抑制精子冷冻过程中的被动获能,显著改善猪精液的冻后质量。

他克林在猪精液液态保存中的应用

为了进一步改良猪精液常温和低温保存稀释液配方，为抗凋亡药物他克林在猪精液液态保存中的研究与应用提供参考依据，试验将0，0．05，0．10，0．15mmol／L他克林加入猪精液常温和低温保存稀释液中，以精子稀释后活力、有效存活时间、总存活时间及存活指数为检测指标，探讨其在猪精液常温（16—18℃）与低温（0—5℃）保存中的应用效果。结果表明：在常温保存时，他克林不能显著提高精子稀释后活力，但可以显著延长精子有效存活时间，或极显著延长精子总存活时间及存活指数，其中O．10mmol／L他克林效果最好；在低温保存时，他克林不能显著提高精子稀释后活力及存活指数，但可以极显著延长精子总存活时间，浓度为0．10mmol／L时还可以显著延长精子有效存活时间。说明他克林对延长猪精子常温或低温保存时间有正面作用。

水蛭素对冷冻前后猪精液中过氧化氢酶活性及mRNA表达的影响

用含不同浓度(0、0.04%、0.08%、0.12%)水蛭素的稀释液稀释美系长白公猪精液,0.5mL细管分装冷冻,分别检测平衡后及冻融后精液中过氧化氢酶的活性和mRNA表达量的变化。结果显示,不含水蛭素的冷冻稀释液显著降低新鲜猪精液过氧化氢酶活性(P<0.05),而含有0.08%水蛭素的冷冻稀释液显著提高冷冻保存猪精液过氧化氢酶活性(P<0.05);不含水蛭素的冷冻稀释液降低新鲜猪精液过氧化氢酶mRNA的表达,含有0.08%水蛭素的猪精液平衡及冻融后的过氧化氢酶mRNA表达量最高,但差异不显著(P>0.05)。结果表明,添加0.08%水蛭素显著提高冷冻前后猪精液过氧化氢酶活性(P<0.05),但对过氧化氢酶mRNA表达的影响并不显著。