Nsp9基因在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

试验旨在验证Nsp9基因是否影响猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的复制。构建含有Nsp9全长基因的质粒pIRES2-EGFP-Nsp9,并转染到Marc-145细胞中,接毒之后分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法测定PRRSV N蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。结果显示,转染Nsp9基因的Marc-145细胞上PRRSV的N蛋白在mRNA水平上显著高于未转染Nsp9基因的对照组(P<0.05),是对照组的1.5倍,同时转染Nsp9基因后的Marc-145上PRRSV N蛋白水平也明显高于对照组。随着剂量的增加,N蛋白的表达量在mRNA和蛋白水平都有所增加。由以上结果初步可知,Nsp9基因可以在Marc-145细胞上促进PRRSV的复制,Nsp9基因与其复制密切相关。

猪繁殖与呼吸综合征病毒FS株Nsp9基因的克隆与序列分析

为了对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp9基因的功能进行预测,利用RT-PCR法从细胞毒中扩增PRRSV FS株的Nsp9基因,并将其克隆至pMD18-T载体上,测序得到Nsp9基因序列,利用多种生物信息学软件分析Nsp9序列生物学信息。结果显示,Nsp9基因全长1 929bp,目的基因的蛋白分子质量为70.5ku,pI为7.78,表明该蛋白不稳定;抗原性分析显示,Nsp9基因存在多个抗原位点,柔韧性较好,多处位点的亲水性较强,适合作为单抗制备的表位;同种亚型不同毒株的Nsp9基因氨基酸同源性为96.9%~98.9%,这表明Nsp9基因高度保守,可进一步作为检测靶蛋白用于猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的诊断与疫苗免疫;亚细胞定位预测该基因可能定位于细胞质中,而不是细胞核内;同源建模预测三级结构结果显示,三维结构呈右手型,具有3个亚结构域,没有信号肽。此外,亲本株Nsp9基因与疫苗株Nsp9基因存在多个氨基酸的突变,这些氨基酸的插入与缺失是否与病毒的聚合酶活性和毒力有关还需要进一步试验验证。

Nsp9基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在感染细胞过程中表达量的变化

试验旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp9基因的实时荧光定量PCR检测方法,并探究其在感染细胞过程中表达量的变化。根据PPRSV Nsp9基因序列设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测模式的实时荧光定量PCR。结果显示,PRRSV Nsp9基因在1×104~1×108拷贝/μL范围内有很好的线性关系,扩增产物的熔解曲线只有1个单特异峰,无引物二聚体。该方法与猪戊肝病毒（HEV）、猪流感病毒（SIV）、伪狂犬病病毒（PRV）基因组均无交叉反应,可重复性好,组内变异系数小,可用于临床PRRSV检测。在病毒感染细胞过程中,Nsp9基因表达量逐步升高,36h达到最高。本研究为探究病毒复制规律与临床疫苗生产奠定了理论基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白单克隆抗体制备与鉴定

根据NSP9非结构蛋白参数选取相应30 bp DNA片段,片段串联后人工合成并连接p ET-28a(+)载体,大肠杆菌BL21中表达得到可溶蛋白,镍柱亲和层析纯化后免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞骨髓瘤细胞融合。细胞融合后利用间接ELISA法杂交瘤细胞阳性克隆筛选,2次亚克隆后共获得3株抗PRRSV NSP9单克隆抗体,命名为3B17、3J13、3F19。这3株单抗可与大肠杆菌表达的蛋白产物和PRRSV感染的Marc-145细胞发生特异性反应。在PRRSV感染的Marc-145细胞中,NSP9蛋白表达水平接毒后不断升高,48 h达最高,为深入研究NSP9功能奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒强、弱毒株Nsp9基因的反向遗传学替换改造

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9基因编码RNA依赖的RNA聚合酶,在病毒复制中发挥重要作用。为了探索Nsp9基因与病毒的毒力、复制能力及细胞嗜性的相关性,本研究利用反向遗传学技术将PRRSV弱毒疫苗毒CH-1R的Nsp9基因进行克隆,酶切后连接到强毒株XH-GD的感染性克隆上,进行病毒的拯救。结果表明,成功构建替换了CH-1RNsp9基因的重组病毒。对重组病毒的生物学特性研究发现,拯救病毒的生长速度和病毒滴度明显高于亲本毒株rXH-GD,但是低于疫苗毒CH-1R,重组毒株的噬斑大小与CH-1R相似,初步推测疫苗株CH-1R的聚合酶有助于提高病毒的滴度。本试验为进一步研究Nsp9基因对病毒毒力的影响奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白的亚细胞定位与功能预测

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白9(NSP9)的亚细胞定位,并探索NSP9蛋白在PRRSV复制过程中的定位变化,首先预测NSP9蛋白的生物信息学功能,之后将含有NSP9基因的质粒转染Marc-145细胞,并接种PRRSV,通过间接免疫荧光方法检测NSP9蛋白的表达与定位情况。功能预测结果表明,NSP9蛋白内部存在双向核定位序列、酰胺化位点、N-糖基化位点、酪蛋白激酶磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、细胞结合位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、伸展蛋白重复区域、RNA聚合酶结合区域。间接免疫荧光检测结果显示,PRRSV感染之初,NSP9蛋白定位在Marc-145细胞质中,围绕在细胞核附近,随PRRSV感染时间延长,其逐步往细胞核内转移,转移的面积也逐步增多。可见,PRRSV感染会引起NSP9蛋白向核内转移。

PRRSV强、弱毒株Nsp9基因对PRRSV复制的影响

为了探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强、弱毒株的Nsp9基因对PRRSV复制的影响,构建含有PRRSV XH-GD强毒株、CH-1R弱毒株Nsp9全长基因的质粒p IRes2-EGFP-Nsp9-XH-GD、p IRes2-EGFP-Nsp9-CH-1R,并将重组质粒分别转染到Marc-145细胞中,以MOI=1的剂量接种PRRSV XH-GD毒株,通过TCID50试验测定病毒的滴度,采用荧光定量PCR和Western Blot方法来测定病毒的N蛋白表达情况。结果表明,转染弱毒株CH-1R Nsp9基因的Marc-145细胞中,PRRSV的N蛋白在mRNA水平、蛋白质水平上的表达量均高于转染强毒株XH-GD组,且病毒的滴度也显著高于转染强毒株XH-GD组。综上,在Marc-145细胞中,弱毒株CH-1R Nsp9基因对PRRSV复制的促进作用优于强毒株XH-GD。

初产妇乳汁不足与穿戴衣着的调查分析

目的 调查分析初产妇乳汁不足与穿戴衣着的关系。方法 采用病例-对照的流行病学调查方法，以乳母24～32岁，产后1～6月的初产妇为对象。其中，泌乳正常116例，泌乳不足132例。结果 乳汁不足的乳母中有74．2％穿戴过紧的乳罩和特身内衣，而对照组的乳母仅为36．2％，两组比较有显著性差异（X^2=37．648，P〈0．01）。结论 初产妇乳汁不足与穿戴过紧的乳罩和紧身内衣有密切相关，泌乳不足各年龄间无明显的差异。

浅谈EXCEL在鉴定工作的数值自动修约中的应用

使用EXCEL进行数值自动计算及修约工作,仅需确保原始数据录入的正确性,无须再走传统的计算、录入、核对过程,就可得到正确的结果。减轻了工作量,有效提高了工作效率。

微波消解ICP-AES同时测定南美对虾饲料中5种有害元素

采用微波消解法,以HNO3-H2O2对样品进行消解,用电感耦合等离子体发射光谱法同时测定南美对虾饲料中的砷、铅、铬、汞和镉5种有害元素。结果表明：该方法灵敏度高,准确性好,各元素测定结果的相对标准偏差在0.6%~2.34%,加标回收率在93%~106.2%,有效降低了试剂消耗,提高了检测效率。

犬巴贝斯焦虫病的诊治报告

焦虫以蜱虫为传播媒介，焦虫通常成单个或成对寄生在动物体的红细胞内。临床上以严重贫血、高热、黄疽、消瘦、四肢无力、食欲不振、以及血红蛋白尿为特征，是一种严重的寄生原虫病。该病病程短，死亡率高。春、夏、秋季南方温热多雨，空气潮湿，草木茂盛，犬被主人经常带到草地或丛林中玩耍而被感染，因此流行具有明显地方性和季节性特点。笔者在工作过程中，接触过多起犬感染巴贝斯焦虫病例，现将其中二例报告如下。

氢化物发生-原子荧光光谱法测定食品添加剂碳酸钙中的砷

用氢化物发生-原子荧光光谱法测定食品添加剂碳酸钙中的砷,优化了仪器的工作条件,考察了酸度、还原剂和预还原剂的影响以及共存元素的干扰情况。结果表明,加入硫脲-抗坏血酸溶液后,碳酸钙中可能存在的共存元素铁、铅、镉、铜、硒、锡、铬、锌等不干扰砷的测定。方法检出限为0.0124μg/L,回收率为101.2%—102.0%,精密度为0.37%。该法具有操作简单,灵敏度高,重现性好等优点,能满足日常检验的要求。