受体胚龄对鸡原始生殖细胞移植后归巢的影响

【目的】探究受体胚龄对鸡原始生殖细胞(Primordial germ cell,PGC)移植后归巢的影响,确定最佳回注时间窗口,为提高转基因鸡的生产效率提供参考依据。【方法】从广西黄羽鸡胚分离获得PGC,体外培养并进行转基因操作后,移植回注到不同胚龄的受体鸡胚中,移植5 d后分离性腺拍照观察,对比受体鸡胚孵育至14HH^17HH时对PGC迁移归巢到性腺的影响。【结果】分别在14HH^17HH胚龄时移植回注PGC,移植5 d后的鸡胚死亡率为30.0%~60.9%,但不同移植胚龄间的差异不显著(P>0.05)。根据鸡胚性腺中的GFP阳性细胞数可划分为6个等级(I^VI),且随着移植胚龄的增加,PGC迁移效率呈下降趋势。14HH胚龄移植的鸡胚性腺GFP阳性细胞集中在V级(40.0%),15HH胚龄移植的集中在III级(42.1%),16HH和17HH胚龄移植的则集中在II级(45.4%和54.5%),GFP阳性细胞含量最高等级(VI级)仅出现在14HH胚龄移植的鸡胚性腺中。【结论】随着受体胚龄的增加,PGC迁移效率呈下降趋势,但鉴于实际操作的难易程度,确定PGC移植回注的最佳时间窗口为14HH鸡胚(孵育50 h)。

影响哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的因素

从屠宰场收集具有高遗传价值的卵母细胞进行冷冻保存,生产可移植胚胎,这为补充宝贵的种质资源以及物种遗传改良提供机会。虽然玻璃化冷冻技术已经成功保存了几种动物的卵母细胞,但由于卵母细胞对低温极其敏感,导致其进展十分缓慢。本文主要综述了卵母细胞脂质含量、卵丘细胞层、冷冻卵母细胞阶段、冷冻保护剂等因素对哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的影响,为改善卵母细胞冷冻效果指引方向。

丝裂霉素C对制备干细胞饲养层效果的影响

【目的】筛选出丝裂霉素C制备干细胞饲养层的最佳处理浓度，为建立完善干细胞饲养层培养体系奠定基础。【方法】以STO（sIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系）、MEF（原代分离的小鼠胎儿成纤维细胞）和BRL（大鼠肝细胞）为研究对象，分别以0、2．5、5．0、10．0、15．0、20．0μg／mL丝裂霉素C处理汇合度为90％～100％的STO、MEF、BRL细胞单层2h，继续培养3d后统计各处理组饲养层细胞的存活数量及增殖细胞比例，并用EdU免疫荧光标记法检测细胞的增殖状况。【结果】随着丝裂霉素C处理浓度的增加，饲养层增殖细胞数量占总细胞数量的比例均呈逐渐降低趋势。丝裂霉素C处理STO、BRL、MEF的最佳浓度分别为5．0、10．0和10．0Izg／mL，对应的增殖细胞比例分别为6．8％、3．O％和2．1％。【结论】丝裂霉素c能有效抑制干细胞饲养层细胞的增殖并保持良好活性，但不同饲养层细胞的最佳处理浓度有所差异。

利用胞浆内单精子注射技术研究水牛与猪的种间受精:阶段性报告

胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)是一种研究种间受精机制的有效工具。本文旨在采用ICSI方法来构建水牛-猪种间显微授精卵,探讨了水牛-猪种间显微授精卵早期发育并检验了几种提高其发育潜力的方法。研究表明:(1)经ICSI方法制备的水牛-猪种间显微授精卵可以形成双原核,并能够发育到囊胚期;(2)PZM-3相对于SOF而言要更适于水牛-猪种间ICSI胚胎的培养;(3)用甲基化酶抑制剂5-azacytidine(5-Aza C)对水牛精子进行处理可以在一定程度上提高水牛-猪种间ICSI卵的原核形成率,但并不能提高其发育潜力。综上,本研究可为进一步探索水牛-猪种间受精机制及精卵互作奠定基础。

水牛精原干细胞研究进展

精原干细胞(SSCs)是一类能够不断地进行自我更新和分化,并能保证遗传物质在亲子代之间有效传递的成体干细胞。伴随着各种移植技术、细胞体外培养及冻存等技术的发展,精原干细胞的应用成为可能,其在生产转基因动物及保护珍稀物种等方面有着广阔的应用前景。本文对水牛SSCs的生成、分离、纯化、培养、鉴定以及冻存的研究进行了系统的阐述。

叶酸对猪卵母细胞体外成熟后微管和微丝分布的影响

本试验探讨叶酸对猪卵母细胞体外成熟的影响,为提高其体外成熟效率提供参考。将体外收集的猪卵母细胞随机分成对照组和试验组(0 ng/m L,1 ng/m L,50 ng/m L),研究添加叶酸对猪卵母细胞体外成熟后纺锤体微管、染色体和微丝分布的影响。结果表明:10 ng/m L叶酸能有效的提高纺锤体微管、染色体和微丝正常分布率,与对照组相比具有上升趋势。当叶酸浓度为50 ng/m L时,纺锤体微管、染色体和微丝正常分布率呈下降趋势,其中微丝正常分布率显著低于10 ng/m L处理组(p<0.05)。综上所述,叶酸能提高猪卵母细胞体外成熟后纺锤体微管、染色体和微丝正常分布率,在本研究中以添加10 ng/m L叶酸效果最明显。

低氧对体外培养鸡原始生殖细胞凋亡的影响

本研究的目的是通过低氧处理体外培养的鸡原始生殖细胞(Primordial germ cell)优化培养系统,降低细胞凋亡率,提高细胞活力,为高效生产转基因鸡提供科学依据。研究采用低氧气体(1%O2)分别处理鸡PGCs 6 h、12 h、24 h,随后用q-PCR检测凋亡相关基因Caspase3的表达。与常氧组(21%O2)相比,1%O2-24h低氧组Caspase3显著下调(p<0.05)。进一步检测1%O2-24 h低氧组p53和Bcl2的表达情况,结果显示p53表达显著下调(p<0.05),Bcl2表达无显著差异。采用流式细胞术检测细胞凋亡比例,低氧组((13.5±0.8)%)凋亡比例低于常氧组((21.8±2.1)%)。采用q-PCR,免疫荧光染色,细胞迁移鉴定低氧处理后的鸡PGCs生物学特性,发现其仍保持生殖细胞的生物学特性。本研究表明,在体外培养条件下,1%O2低氧处理鸡PGCs 24 h能抑制细胞凋亡,且不改变其生物学特性。

有无卵丘细胞对猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻的影响

本研究探讨卵丘细胞对猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响。根据卵丘细胞层数将体外收集的猪卵母细胞分成对照组、A组(3层以上卵丘细胞)、B组(2~3层以上卵丘细胞)、C组(裸卵),研究卵母细胞玻璃化冷冻后的存活率、成熟率和孤雌激活后发育潜能的变化。结果表明:玻璃化冷冻后B组和A组的卵母细胞存活率显著高于C组(p<0.01);冻融后的卵母细胞在成熟率方面的表现为:A、B、C三组的成熟率分别为22.17%、27.2%和18.15%,其中B组的成熟率显著高于C组(p<0.05),但均明显低于对照组(p<0.01)。通过进一步的孤雌激活发现,冻融后卵母细胞的卵裂率、4~8细胞卵裂率和囊胚率在3组中均无显著性差异(p>0.05),均显著低于对照组(p<0.01),但B组与其中两组相比具有上升趋势。综上所述,玻璃化冷冻时保留部分卵丘细胞可以降低冷冻对猪GV期卵母细胞造成的损伤。

水牛精原干细胞电转染条件的优化

本研究采用电转染法将pmaxGFP-gcc质粒通过Lonza电转仪转染入体外培养的水牛精原干细胞。通过将7组电脉冲程序的转染结果进行对比,得出水牛精原干细胞存活率与转染率最高的组别,并确定对应的最佳的电转染程序为EH100,48 h后,流式细胞仪筛选获得此电转染程序下有19.1%的GFP;细胞且转染细胞存活率达到74.2%。本电转染实验操作简便,转染效率高,可重复性好。本实验中的电转染的方法可以用于普通方法难以转染的干细胞,为其他物种的精原干细胞转基因研究提供研究基础和参考。

25-羟基胆甾醇对鸡原始生殖细胞增殖的影响

本研究为了优化现有的鸡PGCs(原始生殖细胞)的培养系统,为今后研究生殖细胞发育与生产转基因鸡奠定良好基础。分别用含0μmol/L(对照组)、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L 25-羟基胆甾醇的培养液培养鸡PGCs,5 d后细胞计数检测其细胞增殖情况。与对照组(不添加25-羟基胆甾醇的鸡PGCs培养液)相比,0.1μmol/L处理组细胞数目没有显著差异,0.5μmol/L和1μmol/L处理组细胞数目均显著增加。对1.0μmol/L 25-羟基胆甾醇处理的鸡PGCs用RT-PCR、细胞免疫染色、细胞注射迁移的方法检测处理后的生物学特性,发现处理后的鸡PGCs仍然保持正常的生殖细胞生物学特性。本研究表明25-羟基胆甾醇能有效的促进鸡P GCs的增殖,且不改变鸡PGCs的生物学特性。

叶酸对猪卵母细胞体外成熟的影响

将体外收集的猪卵母细胞随机分成对照组和试验组(0、1、10、50μg/L),研究叶酸对猪卵母细胞GVBD率、成熟率和孤雌激活发育潜能的影响。结果表明,10μg/L叶酸能有效的促进GVBD发生、成熟率和激活胚的发育能力,与对照组相比具有上升趋势,其中成熟率显著提高(P<0.05)。当叶酸质量浓度为50μg/L时,GVBD率、成熟率和激活胚的发育能力呈下降趋势,其中GVBD率(P<0.05)和成熟率(P<0.01)显著低于其他处理组。综上所述,叶酸能提高猪卵母细胞体外成熟效果,在本研究中以添加10μg/L叶酸效果最明显。

不同日龄巴马小型猪睾丸内精原干细胞的鉴定

精原干细胞的鉴定对于精原干细胞的体外研究非常重要。本研究证明1月龄巴马小型猪睾丸没有启动精子的发育,而2月龄的巴马小型猪已经启动了精子发育,在其精细小管中发现了精子细胞和精子。免疫荧光染色的结果证明1月龄巴马小型猪精原干细胞表达UCHL1,可以与植物凝集素DBA结合,个别的精原干细胞表达CDH1,但不表达C-KIT。2月龄巴马小型猪精原干细胞只表达UCHL1,不表达CDH1和C-KIT,也不能与DBA结合。这些生物标志物的发现为体外培养的精原干细胞的鉴定奠定了基础。