生物技术清洁生产替代高污染化学法制备甲壳素的研究与应用

从虾壳中分离到一株乳杆菌BR-3,研究发现其最佳发酵起始pH为6.50,最佳培养温度为35℃,在此培养温度下达到对数生长期的时间为42h。采用乳杆菌发酵方法,进行了虾壳制备甲壳素的研究,比较了接种量、葡萄糖加入量、发酵时间等因素对产品质量的影响。结果表明,当接种量为10%、葡萄糖浓度为4.5%、固液比为1︰3、发酵温度为(35±2)℃、发酵时间为3—4d时,平均灰分去除率达95.67%,甲壳素产品灰分含量均小于6%,最低可达1%,产品质量等于或优于传统的酸碱生产方法。发酵液可部分或全部回收,洗涤废水可作下一轮发酵用水,生产废水接近零排放。虾壳乳酸发酵法生产甲壳素是一种清洁生产方法。BR-3培养时间短,培养条件粗放,温度和pH适应范围宽,产酸效率高,残糖少,适合于工业化生产。

固定化微生物联合大型水生植物净化养殖废水的实验研究

在实验室条件下，以固定化菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、弯曲芽孢杆菌限flexus）和大型水生植物粉绿狐尾藻（Myriophylluma quaticum）为实验材料，研究微生物与水生植物两者单独或联合作用等不同处理模式对水体不同形态氮素的去除效果及氨化细菌（AB）、亚硝化细菌（NOB）、硝化细菌（NB）和反硝化细菌（DB）4类氮循环细菌的动态分布情况，实验阶段为25d。结果表明，与固定化微生物（I）、粉绿狐尾藻（M）分别单独作用相比，两者联合作用（I＋M）对水体氮素和CODM。的去除效果显著。比较实验前15天，I＋M对养殖废水亚硝态氮（N02．N）和铵态氮（N嘭一N）的去除率分别达50．83％和62．38％，显著高于I（39．55％和51．17％）与M（40．78％和53．31％）（P〈0．05）。实验结束时，I＋M水体CODM。的去除率达67．23％，显著高于I（48．23％）与M（33．35％）分别单独作用（P〈0．05）；I＋M对养殖废水硝态氮（NO；．N）的去除率高达88．74％，显著高于I（67．85％）（尸〈0．05），但与M无显著差异。另外，I＋M植物根系表面4类氮循环细菌的数量相比M组均有不同程度的增加，而载体表面的4类氮循环细菌数量实验后期整体呈现下降趋势，其中I＋M载体表面AB数量始终比I低1．8-2．6个数量级。主响应曲线分析（PRC）表明，水体浊度、N0；．N、TN等对造成组间差异的贡献较大，实验前中期I＋M组对养殖废水的净化效果强于两者分别单独作用，但实验末期I组与UC组间的总体差异大幅度减小，且I＋M与M的差异很小。结论认为，利用固定化微生物与粉绿狐尾藻联合处理循环养殖废水能有效提高对养殖水体NO2-．N、NH4＋-N、CODMn等的去除效果，从而减轻氨氮和亚硝态氮等物质对养殖生物的毒害，使得养殖生物能维持正常的物质代谢，但在实际工厂化养殖生产中应综合考虑养殖废水的水质状况、固定化菌种组分及其生理生化特性、植物种类及搭配等因素，使反应器的设计更加科学以确保系统稳定、高效、持久地运行。本研究旨在为构建高效、稳定的养殖废水生态净化模式提供科学依据。

大黄鱼肝脏蛋白质组双向电泳技术的建立及优化

通过对不同裂解液配方、等电聚焦程序和上样量等条件的对比试验,建立和优化了大黄鱼肝脏蛋白质组双向电泳的相关技术体系。试验结果表明,裂解液中添加Tris和TBP,聚焦时适当延长除盐时间,提高聚焦电压和功率,能显著提高双向电泳图谱的分辨率,而17 cm pH 5-8 IPG胶条的最佳上样量为2.0 mg。通过相关条件优化提高了大黄鱼肝脏蛋白双向电泳图谱的分辨率,为大黄鱼肝脏蛋白质组学的进一步研究奠定了基础。

海洋放线菌XS904分类鉴定及其发酵液抑菌活性的研究

采用形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及16S rDNA序列分析方法,对从宁波海域滩涂泥样中筛选到的一株放线菌XS904进行分类鉴定,同时对XS904菌株发酵液的抑菌活性和抑菌物质的理化性质进行了研究。结果表明,XS904菌株为链霉菌属灰浅红链霉菌(Streptomyces griseorubens)的变种;经液体培养,XS904菌株发酵液对革兰氏阳性细菌有显著的抑菌活性,对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度为0.78%;pH纸色谱和捷克八溶剂系统纸层析结果显示发酵液中的抑菌活性物质为一类中等极性的碱性抗生素,易溶于三氯甲烷,对温度较敏感,在酸性和中性条件下稳定。

鲐鱼中产组胺菌的分离筛选与生物学特性初步研究

利用产组胺菌鉴别培养基,对鲐鱼内脏中产组胺菌进行初步筛选,结合高效液相色谱分析方法对分离菌株的产组胺能力进行了确认;并通过菌株的生理生化、形态和16SrDNA基因序列分析对分离得到的菌株进行鉴定;研究了温度和pH对菌株生长和产组胺的影响。结果表明,从鲐鱼中初步分离的4株菌(T4、T5、T6和T9)在组胺发酵培养基中能够产生164.1～466.1μg/100mL组胺;经生理生化特性及16SrDNA序列测定为相同菌种,对其中T4菌株进行进化树分析,发现菌株T4与产粘液变形杆菌相似性最高。T4菌株生长和产组胺的最适温度均为20℃,最适pH均为7。

原核生物16S rRNA基因多重拷贝及其序列异化

核糖体小亚基RNA(16S rRNA)分子存在于所有细胞生物中,在细胞中执行恒定的功能,其分子序列既有高度保守性片段,又有相对可变性部分,因而成为研究原核生物系统发育的理想分子,其基因已成为原核生物系统分类学研究的核心标识基因。但是,近年来的大量研究表明,原核生物基因组内16S rRNA基因是多拷贝的。16SrRNA基因拷贝数在种属水平上基本是稳定的,但在更高分类阶元上则是不确定的。在拷贝数多的菌株中各拷贝间还存在差异,这种差异有时会大于不同菌株间甚至不同种间的差异。原核生物基因组内16S rRNA基因拷贝数和异化与其利用环境资源的生态策略和对环境的适应性有关。原核生物16S rRNA基因拷贝数及其异化研究对深入理解原核生物的环境生态功能具有重要意义。

培养液组胺的检测及鲣鱼产组胺菌的生物活性评价

通过直接将培养液中的组胺经丹酰氯衍生化生成稳定的物质,以1,7-二氨基庚烷为内标,建立高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-VWD)方法检测培养液中的组胺;并研究了温度和pH对产组胺菌生长和组胺产生的影响。结果表明,培养液中组胺的检测方法定量限为0.5μg/mL,回收率在100%～107%,满足方法培养液中组胺的检测。经分离得到的2株产组胺菌分别记为J2和J4,2株菌在添加L-组氨酸的胰酶大豆肉汤里均能够产生组胺;菌株J2和J4最适生长温度均为30℃,最适pH分别为7和6,菌株J2和J4产组胺的最适温度分别为25℃和30℃,最适pH均为5,在适宜的实验条件下组胺产生量最大值为12.47 mg/L。

可口革囊星虫(Phascoloma esculenta)铁结合蛋白基因的研究

根据已报道的铁结合蛋白基因的保守序列设计引物,用cDNA末端快速扩增(RACE)法,成功地从可口革囊星虫体液中获得铁结合蛋白基因的全长序列。结果表明,该基因cDNA全长1017bp,5′-端非编码区为151bp,3′-非编码区为341bp,开放阅读框长度为525bp(包括一个终止密码子),可编码175个氨基酸(GenBank:EU091352)。该序列与加洲海兔、皱纹盘鲍、刺参、微小牛蜱、叉尾、非洲爪蟾、小家鼠、人等的铁结合蛋白基因有67%—75%的同源性,而相应的氨基酸同源性为59%—76%,氨基酸相似性为74%—89%。分析结果表明,铁结合蛋白基因在动物进化中是高度保守的。

微囊藻水华对淡水浮游动物轮虫和枝角类影响的研究进展

微囊藻是最为常见也是研究最多的水华蓝藻之一。有关微囊藻对浮游动物尤其是对枝角类溞属动物的影响,目前国内外已广泛报道。总体而言,产毒微囊藻对浮游动物具有明显的负面影响,但不同浮游动物对这种影响表现出不同的响应。关于微囊藻对浮游动物的毒性效应及影响,存在着一些相互冲突的观点并有很多种解释。本文就微囊藻水华对枝角类和轮虫的摄食、生长、繁殖和种间竞争的影响进行了综述,同时对由此引发的适应性特征进行了概述,旨在总结前人的研究成果,为今后的研究提供参考依据。

一株引起香鱼出血症的嗜水气单胞菌的鉴定

从发生出血症的香鱼体腔液分离到一高致病性的菌株（ayu-ah0201）,经人工侵染试验证实该菌能引起香鱼出血症。对该菌的形态、生理生化及16S rDNA序列分析结果表明,其为革兰氏阴性,短杆状,极生鞭毛。对蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷、氧化酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶呈阳性,鸟氨酸脱羧酶呈阴性。可利用葡萄糖产酸产气。在以该菌16S rDNA序列和GenBank数据库内同源性较高的细菌16S rDNA序列构建的系统发育树,表明分离菌ayu-ah0201与嗜水气单胞菌聚在一簇,与嗜水气单胞菌核苷酸序列同源性最高,为99.6%~99.7%,与其他相关气单胞菌属成员的核苷酸序列同源性小于98.9%。结合形态和生理生化特点将其鉴定为嗜水气单胞菌。

象山港春季网采浮游植物的分布特征及其影响因素

根据2010年春季象山港28个站位的网采样品,共鉴定出浮游植物6门55属158种,其中硅藻135种(占总丰度的99.0%),甲藻18种,其余门类(金藻、蓝藻、绿藻和隐藻)5种。浮游植物平均丰度为35.29×104个/m3,其分布呈较强的斑块状(3.41×104—142.35×104个/m3),高值区位于横山至白石山水域及乌沙山电厂邻近水域。Shannon-Weiner多样性指数和Pielou均匀度指数总体表现为港口和港口外高于港中部和港底。琼氏圆筛藻(Coscinodiscus jonesianus)为绝对优势种,其丰度(284.97×103个/m3)占总丰度的80.8%。典范对应分析结果显示,影响浮游植物群落的主要因子依次为透明度、悬浮物、温度、水深和氮磷比。光照充足、电厂温排水适度温升、营养盐丰富和氮磷比合适(接近Redfield比值16)导致了港内微藻旺发。受径流、水交换和海洋开发等影响,象山港的理化参数表现了明显的斑块和梯度分布,这为浮游植物的生长提供了不同类型的生境,客观上造成了其分布的空间异质性。聚类、多维尺度和相似性分析结果表明,港底、港中部、港口至港口外区域间的群落组成差异较大。结合历史数据分析表明,象山港浮游植物丰度的升高及群落结构的改变与电厂运行、水产养殖、临港工业发展和滩涂围垦等海洋开发活动有关。

低温选择大黄鱼(Pseudosciaena crocea)的肝脏蛋白质组双向电泳分析

采用双向电泳技术,对低温选择组与对照组大黄鱼进行肝脏蛋白质组双向电泳分析。结果表明,低温选择组肝脏蛋白点1673±47个,对照组1651±43个,共有19个蛋白点经低温选择后,表达量显著变化。从中挑选3个差异蛋白点进行肽指纹图谱(MALDI-TOF-MS)或串联质谱(LC-MS-MS)分析,然后MS-BLAST数据库搜寻。低温选择组大黄鱼肝脏MHC和CFL2蛋白表达显著上调,而2-CysPrxs蛋白表达显著下调。说明低温选育组大黄鱼机体抗细胞凋亡能力明显增强,预示低温选择后留下的大黄鱼在低温环境中生存能力更强。

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)转铁蛋白(Tf)基因克隆及序列分析

提要应用RNeasy animal mini试剂盒抽提大黄鱼total RNA,逆转录合成模板cDNA;同时综合分析从GenBank数据库查询到已报道的转铁蛋白(Tf)基因序列,先设计并合成扩增引物扩增出大黄鱼转铁蛋白部分基因序列,再应用RACE技术,克隆出大黄鱼转铁蛋白全长cDNA基因,全长2461个核苷酸,编码661个氨基酸。应用WCG软件包,采用DNADIST和NEIGHBOR分析方法,构建了转铁蛋白系统进化树。树图显示与传统的分类地位大致相符,可以看出转铁蛋白在海水鱼和淡水鱼的进化上的差异,同时也显示大黄鱼Tf与真鲷的同源性最高。

龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)高温逆境代谢产物的GC-MS分析

利用固相微萃取(SPME)和气相色谱/质谱联用技术(GC-MS)分析龙须菜在高温逆境中可挥发性代谢产物的变化规律。最优分析条件为样品60℃平衡30min,用聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯纤维头(PDMS/DVB)顶空萃取吸附25min,在210℃下解吸附5min后对解吸物进行GC-MS检测。结果表明,从龙须菜中检测到56个挥发性代谢产物,在高温逆境条件下主要有烯烃(61.67%)、醛(22.47%)、酮(5.98%)、烷烃(1.92%)、卤代物(0.65%)、醇(0.41%)、酯(0.37%)、其它(1.34%)。比较了常温和高温逆境培养条件下龙须菜中代谢产物的相对含量变化规律:高温胁迫下E-2-戊烯醛等7种代谢产物含量显著减少,三氯甲烷等4种代谢产物含量显著增加。其中E-2-庚烯醛、E,E-2,4-庚二烯醛、2-正戊基呋喃和三氯甲烷可能与龙须菜高温逆境生理有关。本研究可为龙须菜抗逆生理和抗高温品系选育提供理论依据和指导。

丰水期长江感潮河口段网采浮游植物的分布与长期变化

于2009年6、8月对长江口门至江阴的河口段浮游植物进行了拖网采集,共检出浮游植物6门99属239种。其中:硅藻123种,甲藻19种,绿藻和蓝藻各42种,裸藻9种,黄藻4种。河口段网采浮游植物丰度以蓝藻占绝对优势,硅藻次之,两者合计在群落中的比例超过了95%。优势种也主要以蓝藻(水华鱼腥藻Anabaena flos-aquae、柔软腔球藻Coelosphaerium kuetzingiarum、微囊藻Microcystis spp.、颤藻Oscillatoria spp.和席藻Phorimidium spp.)构成,硅藻仅有2种(骨条藻Skeletonema spp.和颗粒直链藻Aulacoseira granulata)。口门内盐度均<0.5,群落基本以淡水类群为主,口门附近则以半咸水类群为主,海水类群主要位于口门外(盐度>13)。随着水温和营养盐水平的升高,8月浮游植物平均丰度(347.75×104个/m3)明显高于6月(204.19×104个/m3)。根据多维尺度和相似性分析,丰水期长江河口段浮游植物群落组成与分布存在显著(P<0.01)的时空差异。对比20世纪80年代以来的历史资料发现,长江口门内网采浮游植物丰度显著升高,且优势种也从硅藻(骨条藻、直链藻和圆筛藻)转变为蓝藻(颤藻、鱼腥藻和微囊藻)。

低强度超声波抑制铜绿微囊藻生长的研究

铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是常见的水华蓝藻,会对湖库的生态环境造成严重危害。室内研究了低强度超声波在不同藻生长时相、藻细胞浓度、水体pH、水温和二次超声条件下对铜绿微囊藻的抑制效果。结果表明:藻细胞浓度和pH对超声抑藻效果无明显影响,藻生长时相、水温和超声次数对超声抑藻效果有明显影响。15℃、20℃和25℃时的超声抑藻效果好于30℃和35℃,不经超声作用40℃高温即已不利于藻细胞生长;低强度超声对延滞期、稳定期和衰退期铜绿微囊藻抑制效果好于指数生长期铜绿微囊藻;二次超声可有效延长残余藻细胞的恢复时间,稳定抑藻效果。

几种菱形藻及其近缘种分类界定的比较研究

菱形藻是较常见的羽纹硅藻类,其中一些种类的外部形态十分相似,差异细微,很难从经典形态分类的角度准确区分,造成此类微藻在分类地位上的混乱。作者综合利用经典形态分类方法、ITS(Internal transcribed spacer sequences)序列分析方法以及基于脂肪酸甾醇的化学分类多种方法,对4株从形态观察初步确定为菱形藻及其近缘种类的野外采集样品以及在分类上仍存分歧的小新月菱形藻(Nitzschia closterium f.minutissima)和三角褐脂藻(Phaeodactylum tricornutum),进行了几种易混淆种类界定的差异比较研究。结果显示,基于多种方法的微藻种类鉴定,能获取比单一鉴定方法更多的鉴定信息,并且几种方法能获得比较一致的结果;分别明确了野外水样中的四株微藻品系的分类地位,其中的3株分别为拟尖刺菱形藻(Pseudo-nitzschia pungens Hasle)、柔弱拟菱形藻(Pseudo-nitzschia delicatissima)、新月筒柱藻(Cylindrotheca closterium),但另外一株仅能确定为细柱藻属的一种,仍不能鉴定到种。分析结果还表明,小新月菱形藻应属于舟形藻目,褐指藻科,褐指藻属,这与之前有学者报道的结果一致。

中华鳖体表和体内菌群多样性分析

采用16S rDNA分析方法,分别提取中华鳖体表和体内细菌总DNA,以之为模板进行PCR扩增获得细菌16S rDNA基因片段,并构建16S rDNA克隆文库。从2个文库中分别随机选取100个重组克隆子,抽提重组质粒,用HaeⅢ和MspⅠ限制性内切酶进行酶切,获得酶切指纹图谱,从每种图谱随机挑选克隆子测序,获得其16S rDNA部分序列,构建了系统进化树。在中华鳖体表和体内细菌克隆文库中分别包含13种和10种RFLP谱型,分别挑选了70个和60个克隆子进行测序。结果表明,中华鳖体表和体内文库克隆子分别归为15类和11类OTU,体表和体内菌群多样性较强,优势细菌类群分别为拟杆菌和变形菌,并在文库中检测到了几株益生菌和条件致病菌。

曼氏无针乌贼副性腺中6种酶的初步研究

采用试剂盒测定了曼氏无针乌贼副性腺产卵前后乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活力,比较其产卵前后的变化,发现产卵后6种酶的活力均有下降。其中产卵前缠卵腺、副缠卵腺中乳酸脱氢酶活力分别为89、57 U/g,产卵后分别为56、45 U/g。产卵前缠卵腺、副缠卵腺中超氧化物歧化酶活力分别为78、47 U/mg产卵后缠卵腺、副缠卵腺中超氧化物歧化酶活力分别为51、32 U/mg。

四种海水养殖鱼类血清转铁蛋白多态性的初步研究

采用PAGE技术测定了大黄鱼、美国红鱼、黑鲷和花鲈四种海水养殖鱼类血清转铁蛋白(Tf)的多态性。研究结果表明:美国红鱼、花鲈、大黄鱼等三种养殖群体Tf有6种表型,受3等位基因控制;黑鲷有9种表型,受4等位基因控制。美国红鱼、花鲈、黑鲷的血清转铁蛋白杂合体基因型均大于纯合体,而大黄鱼的则是杂合体小于纯合体。血清铁浓度:花鲈>黑鲷>美国红鱼>大黄鱼;铁饱和度:黑鲷>花鲈>大黄鱼>美国红鱼。由此推断,黑鲷的耐低氧能力比其他三种海水养殖鱼类强。