NO探针应用于细胞生物学实验的探索

为了将信号分子NO的检测探针应用于细胞生物学实验,使用NO荧光探针DAF-FM双乙酸盐和小鼠腹腔巨噬细胞,设计了"荧光探针检测巨噬细胞中NO含量"的实验项目,并在本科生细胞生物学实验课中实施。得到一定浓度脂多糖和食用菌多糖处理可显著增强巨噬细胞内NO荧光探针平均光密度值(P<0.05)的实验结果。实验表明,NO荧光探针能直观显示细胞中NO合成量的变化,可作为一种简便和可视化的信号分子检测方法,应用于细胞生物学实验教学。

阿魏侧耳胞外多糖分离纯化及其免疫活性研究

研究了阿魏侧耳(Pleurotus ferulae Lanzi)胞外多糖的分离纯化及其对巨噬细胞和脾淋巴细胞的免疫调节作用。采用醇沉、透析、冷冻干燥、DEAE-52柱层析和Sephadex G-100柱层析等方法从发酵液分离纯化阿魏侧耳胞外多糖,通过高效凝胶渗透色谱法与高效液相色谱法测定其分子质量和单糖组成,以灌洗腹腔法和密度梯度离心法分别收集巨噬细胞和脾淋巴细胞,并利用荧光探针法和酶联免疫吸附实验分别测定体外培养的巨噬细胞中NO和活性氧含量及2种细胞培养上清中多种免疫相关细胞因子的浓度。结果表明,阿魏侧耳胞外多糖水提组分PFEPw-1的分子质量为64.2 kDa,由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖组成,含量比为2.42∶3.90∶2.27∶1.41。终浓度为10~30 mg/L的PFEPw-1可显著提高巨噬细胞对NO和活性氧的合成(P<0.05)及肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ的分泌量(P<0.05),20~30 mg/L的PFEPw-1可显著提高巨噬细胞对白细胞介素-1和白细胞介素-6的分泌量(P<0.05)及脾淋巴细胞对白细胞介素-2和干扰素-γ的分泌量(P<0.05)。该研究可为阿魏侧耳胞外多糖的工业化生产及开发应用提供理论支持。

鳞柄小奥德蘑多糖对巨噬细胞免疫功能的调节作用

研究鳞柄小奥德蘑多糖对小鼠巨噬细胞的免疫调节作用。采用灌洗腹腔法收集小鼠巨噬细胞,建立其体外培养体系;采用鸡血红细胞法、荧光探针标记、总一氧化氮检测和酶联免疫吸附试验等方法分别检测巨噬细胞吞噬能力、NO合成量、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、白细胞介素-6和白细胞介素-12等的分泌量。结果显示,与空白对照组相比,鳞柄小奥德蘑多糖能显著增强体外培养和腹腔内巨噬细胞的吞噬能力和NO合成量,增加体外培养的小鼠巨噬细胞对肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、白细胞介素-6和白细胞介素-12等细胞因子的分泌量。因此,鳞柄小奥德蘑多糖可能通过提高细胞对NO和多种免疫相关信号分子的分泌量,增强细胞的吞噬能力,进而调节小鼠巨噬细胞的免疫功能。

香辣公干鱼罐头的加工工艺研究

研究香辣公干鱼罐头的加工工艺,探讨不同的加工条件(卤制时间、酱油与水的体积比、油炸温度、油炸时间)及调味料(白砂糖、味精、花椒粉、辣椒粉)质量分数对罐头感官品质的影响,并对产品进行理化指标测定。结果表明:公干鱼罐头的最佳加工条件为卤制时间为6 min,酱油∶水体积比为1∶5,油炸温度为180℃,油炸时间为40 s,白砂糖4%、味精0.5%、花椒粉0.2%、辣椒粉9%。通过此方法生产的公干鱼罐头色泽金黄,富有嚼劲,口感麻辣鲜香。

我国主要甜瓜病毒的研究及防治

随着甜瓜种植面积不断扩大,病虫害监控防治成为生产优质瓜果的关键环节之一,而病毒病在甜瓜生产过程中危害严重。因此该研究就几种主要的甜瓜病毒,即小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellow virus,CCYV)、甜瓜坏死斑点病毒(Melon necrotic spot virus,MNSV)和甜瓜黄化斑点病毒(Melon yellow spot virus,MYSV)的分类、基因组结构、传播方式、寄主、症状展开论述。并对甜瓜病毒的检测和防治方法进行综述,以期为甜瓜病毒的防控提供依据。

食药用菌多糖抗肿瘤机制的研究进展

肿瘤发病率逐年升高,对人类的危害不容忽视。天然活性物质食药用菌多糖提取工艺成熟,对机体毒副作用小,且具有较高的抗肿瘤药用价值。总结近十年来食药用菌多糖抗肿瘤机制的研究结果,分析了重要食药用菌的抗肿瘤特点、食药用菌抗肿瘤的调控机制及其功效,对多糖作为抗肿瘤纳米药物载体进行了阐述,对促进食药用菌多糖抗肿瘤应用的研究具有指导意义。

香菇提取液在雪花膏工艺优化中抗氧化性的研究

雪花膏的主要成分为硬脂酸、丙三醇、氢氧化钠、氢氧化钾和十八醇、香菇提取液,通过单因素与正交实验得出产品最优配方。然后测定雪花膏的再润湿性和吸湿性,以及添加香菇提取液后羟基自由基的清除率,分析配方的抗氧化特性。最终,硬脂酸添加量为10%、丙三醇添加量为5.5%、氢氧化钾添加量为0.5%、搅拌时间20min、十八醇添加量为3%、香菇提取液添加量为5%时,产品品质最优。

生物膜管对蛋白质自组装行为的调控研究

以无水模型耗散粒子动力学模拟为手段,把不同形貌的蛋白质粗粒化为刚性纳米粒子,删除无关蛋白质的一些细节结构,系统研究膜张力、蛋白质与生物膜的粘附力及其蛋白质几何形貌的耦合关系以及如何影响其在生物膜管表面的聚集行为。结果发现,随着膜张力减小,粘附力增加,球形纳米粒子达到平衡态时的平均包裹率逐渐增加,并趋于有序的环形自组装结构;棒状纳米粒子的长径比会影响其在膜管表面动力学过程的角度变化,进而影响其最终的聚集形态;月牙形纳米粒子的曲率与膜管曲率匹配时,随着纳米粒子与生物膜粘附力的增加,更易自组装为有序的环形结构。

热应激对中国荷斯坦牛乳腺组织基因表达及信号通路的影响

夏季奶牛热应激问题给奶业生产造成了巨大的经济损失。为揭示奶牛发生热应激后乳腺组织应答反应的分子机制,通过研究热应激奶牛乳腺组织差异表达基因,探究差异基因对乳腺组织转录调控的影响。以8头中国荷斯坦牛为研究对象,分别采集热应激期(8月,温湿指数THI=83.8)和非热应激期(3月,THI=65.8)各4头奶牛乳腺组织,利用HiSeq2000进行转录组测序,并进行生物信息学分析,共发现96个差异表达基因(差异倍数>2),其中上调表达46个,下调表达50个。GO分类结果表明,注释到细胞组分、分子功能和生物学过程的差异基因数量分别为41、38和36个(P<0.05)。KEGG通路分析结果表明,差异基因共富集到18条信号通路(P<0.05),其中6条与疾病有关,9条与代谢有关,此外,与免疫应答相关的细胞因子-细胞因子受体相互作用和NOD样受体信号通路明显富集。通过比较热应激和非热应激奶牛乳腺组织转录组,分析差异基因相关信号通路,为进一步了解奶牛发生热应激反应的分子机制奠定基础。

菊芋查尔酮合成酶基因的克隆与表达分析

为揭示菊芋(Helianthus tuberosus L.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因的功能,以菊芋‘廊芋8号’叶片为材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,克隆得到菊芋CHS基因命名为HtCHS,其编码区全长为1197 bp(GenBank登录号MN124515),编码398个氨基酸。HtCHS的基因组DNA(gDNA)全长为1567 bp,含2个外显子和1个内含子。序列比对和系统进化树分析显示,不同植物中的CHS氨基酸序列具有极高的同源性,菊芋与同属的向日葵CHS氨基酸序列一致性达到99.25%,共聚于一个分支。HtCHS蛋白相对分子质量为43.61 ku,等电点为6.33。HtCHS蛋白具有查尔酮合成酶结构域,属于查尔酮合成酶超家族成员,HtCHS不含信号肽和跨膜区,属于非分泌蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,HtCHS在根中表达量最高。与对照相比,150 mmol·L-1 NaCl和20%PEG 6000处理6 h时HtCHS表达显著上调,处理12 h时显著下调。原核诱导表达分析结果显示,成功诱导出与预测蛋白大小一致的目的蛋白。

胡萝卜类黄酮含量的测定及DcCHS基因家族的鉴定分析

查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是类黄酮合成过程中的第一个关键酶,具有重要的生理功能。测定胡萝卜不同发育时期、不同组织部位的类黄酮含量,并在全基因组水平上对胡萝卜CHS基因家族进行鉴定和分析。结果表明,无论在苗期还是收获期,胡萝卜叶中的类黄酮含量均极显著地高于根中的含量。叶中的类黄酮含量在不同发育时期无显著差异,而根中的类黄酮含量在不同发育时期却差异显著。胡萝卜基因组中共有12个DcCHS基因,分布于5条染色体上,氨基酸序列长度为253~398 aa,外显子1~3个。经预测,DcCHS蛋白均定位于细胞质,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主。DcCHS蛋白可分为ClassⅠ和ClassⅡ两类,含有10种保守基序,motif1、4、6、7为CHS蛋白N端结构域,motif2、3、8为CHS蛋白C端结构域。这些研究结果可为胡萝卜CHS基因的功能研究提供参考。

菊芋HtCCR1基因的克隆与表达分析

肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是木质素合成代谢的关键酶。该研究以菊芋(Helianthus tuberosus L.)‘廊芋8号’为材料,克隆到1个菊芋的CCR基因,命名为HtCCR 1(GenBank登录号为MN205540),其开放阅读框(ORF)长975 bp,编码324个氨基酸,其中含有FR_SDR_e保守结构域。系统进化分析表明,HtCCR1与向日葵CCR蛋白(XP_021989763.1)共聚于一支,二者亲缘关系最近。实时定量PCR分析表明,HtCCR 1基因在菊芋茎和叶中的表达量显著高于在根和块茎中;盐(150 mmol·L^-1 NaCl)胁迫处理6、12和24 h后,处理组HtCCR 1基因的表达量均显著高于对照组;干旱(20%PEG6000)胁迫6和12 h后,处理组HtCCR 1基因的表达较对照组均显著上调。成功构建pET-28a-HtCCR 1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导出了符合预期大小的蛋白,表明HtCCR1重组蛋白已成功表达。该研究结果为进一步研究HtCCR 1基因的功能及利用基因工程手段调节菊芋中木质素的生物合成奠定了基础。

三种伞形科蔬菜作物棕榈酰基转移酶基因家族的鉴定与分析

在全基因组水平鉴定胡萝卜(Daucus carota)、芹菜(Apium graveolens)、香菜(Coriandrum sativum)3种伞形科蔬菜作物的棕榈酰基转移酶(protein S-acyltransferase,PAT),对其家族成员进行生物信息学和表达分析,为深入探究该类蛋白在3种伞形科作物生长发育及抵御逆境胁迫中的作用提供参考。利用Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)和hmmsearch程序,从胡萝卜、芹菜、香菜基因组中筛选、鉴定PAT家族成员;利用TBtools绘制PAT基因染色体分布图;利用Expasy分析PAT蛋白的等电点、分子量;利用TMHMM-2.0预测PAT蛋白跨膜区;利用CELLO v.2.5、WoLF PSORT预测PAT蛋白的亚细胞定位情况;利用MEGA6构建系统发育进化树;利用MEME分析PAT蛋白保守基序;基于荧光定量PCR实验结果及转录组数据,利用TBtools绘制基因表达热图,分析PAT基因的组织表达特性及胁迫响应情况。结果表明,在胡萝卜、芹菜及香菜基因组中各存在27、25、27个PAT基因,分别命名为DcPAT 1~27、AgPAT 1~25、CsPAT 1~27。这些PAT成员不均匀地分布于染色体上,理化性质存在差异,且均为跨膜蛋白。系统进化分析将伞形科及来源于其他物种的PAT蛋白分为7个类群(Group1~7),伞形科作物PAT蛋白在7个类群中均有分布。结构分析表明,所有的PAT蛋白均含有DHHC-CRD结构域,该序列内的保守氨基酸残基在不同物种间已发生变异。荧光定量PCR和转录组数据分析表明,PAT基因在胡萝卜、芹菜、香菜不同组织间的表达水平有差异,但有部分成员在不同组织间均呈现高水平或低水平表达,另有部分DcPAT基因在盐胁迫和低温胁迫处理后,表达水平发生改变。

异源表达菊芋HtHCT基因对受体植物木质素相关生理生化指标的影响

羟基肉桂酰辅酶A:莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(HCT)是木质素合成过程中的关键酶之一。本研究构建了菊芋HtHCT基因的植物表达载体pCAMBIA1390-HtHCT,分别对拟南芥和本氏烟进行遗传转化,并对转基因植株进行生理生化指标测定。PCR和RT-PCR结果表明,HtHCT基因已经插入到受体植物基因组中,并能进行转录;转基因植株生理生化指标检测表明,HtHCT基因能够调节拟南芥和本氏烟中木质素的含量及组成,并对受体材料的类黄酮合成亦有一定的影响。

胡萝卜4CL基因家族的鉴定及分析

旨在全基因组水平上鉴定胡萝卜4CL基因,揭示该基因家族成员的理化性质、系统进化、基因结构、组织表达模式及胁迫响应情况,为胡萝卜4CL的功能研究和利用奠定基础。基于AMP结合结构域(PF00501)的隐马尔可夫模型文件,利用HMMER软件对胡萝卜蛋白质数据库进行检索,获得胡萝卜4CL基因(命名为Dc4CL);利用ProtParam分析Dc4CL的理化性质;利用MEGA6对Dc4CL进行系统进化分析;使用GSDS2.0、MEME分析Dc4CL的基因及蛋白结构;利用荧光定量PCR技术对Dc4CL的组织表达模式及胁迫响应情况进行研究。结果表明,胡萝卜基因组中存在12个4CL基因,分别为Dc4CL1~Dc4CL12。Dc4CL基因开放阅读框(ORF)长度为1350~3363 bp,编码蛋白质长度为449~1120 aa,编码蛋白的分子质量和等电点分别为48.92~123.73 ku和5.34~8.82。系统进化分析表明,Dc4CL与其他来自水稻、拟南芥、二穗短柄草、高粱、大白菜的4CL蛋白可分为两个类群。结构分析表明,Dc4CL基因外显子数目为4~11个,其蛋白序列中均含有BoxⅠ(SSGTTGLPKGV)和BoxⅡ(GEICIRG)两个保守序列。荧光定量PCR结果表明,Dc4CL3、Dc4CL12在胡萝卜叶片及肉质根中均有表达,而Dc4CL8主要在叶片中表达,盐胁迫和低温胁迫均使Dc4CL3、Dc4CL8、Dc4CL12的表达降低。总之,胡萝卜的12个Dc4CL基因在影响4CL蛋白功能的关键位点处具有保守性,而在其他位置上存在一定的差异,且部分成员在逆境胁迫应答过程中可能发挥了一定的作用。

番茄SlNRT2基因家族鉴定、启动子克隆及表达分析

硝酸盐转运蛋白2(Nitrate transporter 2,NRT2),是一种高亲和硝酸盐转运蛋白,在植物对硝酸盐的吸收和转运过程中发挥重要作用。本研究通过生物信息学方法对番茄(Solanum lycopersicum)NRT2(SlNRT2)家族基因进行鉴定,利用热图分析SlNRT2家族成员基因表达模式,并利用启动子嵌合GUS报告基因转化拟南芥对SlNRT2启动子活性进行分析。结果表明番茄基因组中鉴定到5个NRT2基因,定位于细胞膜,氨基酸序列长度介于458~531 aa,等电点介于9.05~9.33,不稳定性指数介于31.84~40.70。基因结构分析表明,该基因家族由3~4个外显子构成。染色体定位分析显示,SlNRT2基因分布于3条染色体上。系统进化和保守结构域分析显示,SlNRT2分别归属于I和II两个类群,具有10种保守基序,蛋白保守性很高。番茄不同组织热图分析表明SlNRT2.1和SlNRT2.2呈组成型表达;SlNRT2.3~SlNRT2.5主要在根部表达。启动子顺式作用元件及GUS组织化学染色分析结果表明,SlNRT2.4启动子驱动GUS基因在拟南芥根部特异性表达,而SlNRT2.3和SlNRT2.5除驱动GUS基因在拟南芥根部表达,叶片也有表达。本研究为后续开展SlNRT2基因的功能研究提供依据,同时为培育氮素高效利用型转基因番茄奠定了基础。

菊芋木质素合成相关基因HtHCT的克隆及表达分析

羟基肉桂酰辅酶A:莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(hydroxycinnamoyl-CoA:shikimate/quinate hydroxycin-namoyltransferase,HCT)在植物木质素合成过程中具有重要作用。本研究以菊芋‘廊芋8号’为材料,成功克隆到一个菊芋HCT基因——HtHCT,其不含内含子,开放阅读框(ORF)为1293 bp,编码430个氨基酸。HtHCT含有HCT蛋白共有的保守序列HXXXD和DFGWG。系统进化分析表明,HtHCT与向日葵HCT蛋白(QBM78942.1)亲缘关系最近,共聚于一支。原核表达结果表明,HtHCT蛋白成功被诱导表达。荧光定量PCR结果显示,Ht HCT基因在菊芋各组织中均有表达,其中茎中表达量最高。此外,HtHCT基因能够响应盐胁迫(150 mmol·L-1 NaCl)和干旱胁迫(20%PEG-6000),NaCl处理24 h的Ht HCT基因表达量显著高于对照,PEG处理12 h的HtHCT表达量与对照相比显著上调了10倍。

番茄SlTIP-1基因的克隆、表达及启动子活性分析

为研究水孔蛋白分子功能,本研究以番茄(Solanum lycopersicum)矮化品种‘Micro-Tom’为材料,采用RTPCR技术克隆得到1个液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)类的水孔蛋白基因,命名为SlTIP-1,其开放阅读框(ORF)长753 bp,编码250个氨基酸。基因结构分析发现SlTIP-1有3个外显子和2个内含子。生物信息学分析表明SlTIP-1蛋白含有6个跨膜区及2个NPA(天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸)基序,具有MIP超家族典型的蛋白保守区序列特征。系统进化分析表明,SlTIP-1蛋白与野生种潘那利番茄TIP共聚于一支。实时定量PCR结果表明,SlTIP-1在番茄根中特异性表达。将SlTIP-1基因起始密码子上游1085 bp的序列构建到植物表达载体pBI121中,转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)并进行GUS组织化学染色分析。结果表明,SlTIP-1基因启动子驱动GUS基因在拟南芥根部特异性表达,与实时定量PCR结果一致。本研究拟为进一步探索该基因的功能及番茄分子辅助育种提供理论依据。

番茄金属硫蛋白基因家族鉴定、SlMT3基因表达及启动子活性分析

金属硫蛋白(metallothioneins,MTs)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白,在维持金属稳态和去除金属毒性方面具有重要作用。本研究通过生物信息学方法对番茄(Solanum lycopersicum)MT家族基因(SlMT)进行鉴定,利用荧光定量PCR技术分析家族成员SlMT3基因表达模式,并利用GUS报告基因对SlMT3启动子活性进行分析。结果表明番茄基因组中共鉴定到5个MT基因,主要定位于细胞质,蛋白序列长度在72~112 aa,等电点介于4.49~5.71。基因结构分析表明,该基因家族由2~3个外显子构成。染色体分布结果显示,SlMT基因分布于3条染色体上。系统进化和保守结构域分析显示,SlMT分别归属于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个亚族,具有3种保守基序,蛋白保守性很高。荧光定量PCR结果表明,SlMT3在番茄根中特异性表达。启动子顺式作用元件及GUS组织化学染色分析结果表明,SlMT3基因启动子驱动GUS基因在拟南芥根部特异性表达,与荧光定量PCR结果一致。本研究为后续开展SlMT基因的功能研究和番茄遗传改良提供理论依据。

番茄SlPP2C67启动子克隆及表达分析

番茄(Solanum lycopersicum)PP2C67基因(SlPP2C67)是番茄蛋白磷酸酶2C基因家族的重要成员。本研究以‘Micro-Tom’番茄为材料,采用PCR方法克隆SlPP2C671657 bp启动子序列。启动子顺式作用元件分析表明该启动子除含有CAAT-box与TATA-box等基本调控元件外,还包含多个组织特异表达元件、光响应元件和激素响应元件。用克隆的启动子同向置换pCAMBIA1300-GN载体上的CaMv35S启动子来构建重组表达载体,然后转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行功能验证。GUS组织化学染色结果表明,SlPP2C67启动子驱动GUS基因在拟南芥叶片特异性表达。实时定量PCR结果表明SlPP2C67基因主要在番茄叶片表达,该结果与SlPP2C67启动子驱动的GUS基因在拟南芥中的表达结果一致。本研究为后续开展SlPP2C67基因的功能研究和番茄遗传改良提供理论依据。