百脉根高频再生体系建立和猪瘟病毒E2基因的遗传转化

在建立百脉根(Lotus corniculatus L.)高频再生体系的基础上,通过农杆菌介导,将猪瘟病毒(CSFV)表面抗原E2基因转化进入百脉根,获得转基因阳性株系5个。并对遗传转化体系中关键性因素进行优化,结果表明,最优化体系为子叶预培养3 d后,用OD600nm为0.5±0.05的菌液侵染30 min,共培养3 d并添加AS(乙酰丁香酮),选择培养基中卡那霉素浓度为50 mg/L,可获得理想的转化效率。为抗猪瘟可食性疫苗的研制奠定基础。

棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析

【目的】克隆棉花精氨琥珀酸合成酶基因Gh ASS1的c DNA序列,并利用原核表达系统高效表达融合蛋白,检测融合蛋白的精氨琥珀酸合成酶活性及其表达对工程菌生长、耐盐能力及与游离L-瓜氨酸(L-Cit)和L-精氨酸(L-Arg)含量的影响,为解析该基因的功能及作用机制奠定基础。【方法】以拟南芥推断的精氨琥珀酸合成酶c DNA序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花幼叶中获得c DNA片段,T/A克隆测序后得其序列信息,利用生物信息学软件分析其DNA结构、蛋白质结构、功能域和同源性,并构建系统进化树。利用q RT-PCR检测其在盐胁迫下的表达模式;将Gh ASS1的开放阅读框连接到原核表达载体p Cold-TF上,构建融合表达载体p Cold-Gh ASS1,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)plys S中进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE法测定表达产物分子量,焦磷酸荧光法测定酶活性和比活力,HPLC法测定工程菌中L-Cit和L-Arg的含量,对比不同温度和不同Na Cl浓度下工程菌与对照菌的生长速度及其体内L-Cit、L-Arg含量及L-Arg/L-Cit。【结果】棉花Gh ASS1存在于D基因组的第1染色体上,由10个外显子和9个内含子构成,其c DNA全长序列共1 584 bp,其中5′非翻译区22 bp,开放阅读框1 485 bp,3′端非翻译区77 bp,编码产物由494个氨基酸组成,推断分子量为54 k D,等电点6.74;序列比对分析表明Gh ASS1与大肠杆菌、酵母和拟南芥中同源蛋白序列一致性分别为21.81%、41.1%和78.5%,且具有典型的精氨琥珀酸合成酶结构模序;系统进化分析显示Gh ASS1与番茄、马铃薯和烟草中同源蛋白亲缘关系最近,而与云杉、卷柏中同源蛋白亲缘关系最远;盐胁迫可上调叶片中Gh ASS1的表达,1 d时达到峰值,随后逐渐下降,推测Gh ASS1参与棉花对盐胁迫的早期响应。表达载体p Cold-Gh ASS1在工程菌中表达的融合蛋白分子量约108 k D,与预期相符,在体外具有精氨琥珀酸合成酶活性;与对照菌相比,p Cold-Gh ASS1工程菌中游离L-Cit含量下降,L-Arg含量上升,且在生长周期中较快进入对数生长期;在含高浓度Na Cl的培养基中p Cold-Gh ASS1工程菌表现出更强的生长活力和较高的L-Arg/L-Cit值,显示了其具有较强的L-Cit向L-Arg的代谢流。【结论】从棉花中克隆了植物精氨琥珀酸合成酶基因c DNA序列Gh ASS1,推测其在植物体内可参与植物的生长和耐盐能力的调控。

百脉根S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因克隆与表达分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC;EC 4.1.1.50)是多胺合成过程中的限速酶。以日本百脉根EST序列为基础,通过设计特异引物进行RT-PCR扩增,获得了S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶编码cDNA,命名为LcSAMDC1。LcSAMDC1基因组序列全长2 626 bp,存在3个内含子;cDNA序列全长1 799 bp,存在3个植物SAMDC基因特征性ORF,其中tORF编码2个氨基酸残基,sORF编码55个氨基酸残基,mORF编码354个氨基酸残基;mORF编码产物推断的分子量为38.6 kDa,具有2个高度保守的功能结构域(酶原剪切位点和PEST结构域);半定量RT-PCR分析显示,LcSAM-DC1在幼叶和根中具有高水平的表达,在茎中表达水平较低,而在成熟叶片中不表达。

植物“液泡膜”H^+ -PPase的功能与应用

H+-PPase是一类将焦磷酸水解与质子转运相耦联的焦磷酸酶。在植物中,主要定位在液泡膜,少量定位于细胞质膜,除具有酸化液泡、有助于有毒离子的液泡区室化功能外,还有调控质膜H+-ATPase介导的根际酸化,促进氮、磷吸收的功能。本文就植物"液泡膜"H+-PPase的定位、结构与性质、调控与作用机制及其在基因工程中的利用等方面展开论述,旨在使研究者系统地了解"液泡膜"H+-PPase的研究进展,为未来通过调控H+-PPase的表达来改进植物的生长发育、抗盐耐旱能力、氮、磷肥的利用效率等生产应用提供参考。

百脉根液泡膜H^+-PPase基因LcVP1植物表达载体构建与转基因毛白杨的获得

为通过基因工程手段进行杨树耐盐性状的遗传改良,笔者分析已克隆的百脉根液泡膜H+-PPase基因LcVP1的cDNA序列,根据其与植物表达中间载体pGN上的酶切位点设计1对带酶切位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增百脉根液泡膜H+-PPase基因开放阅读框片段。双酶切PCR回收产物和pGN载体,将目的片段定向连接构建成植物表达载体pGVP,并转入根癌农杆菌;在此基础上,利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将百脉根液泡膜H+-PPase基因转入毛白杨基因组中。转基因杨树的获得,为获得耐盐性提高的杨树品系提供了基础。

外源NO供体SNP对冬季温室芹菜生长及硝酸盐含量的影响

在冬季温室条件下,分别对种子萌发期、幼苗期和快速生长期的芹菜(Apium graveolens L.)喷施0、20、50、100、200μmol/L的外源一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)溶液,测定种子萌发率、单株株高和重量、根系发育以及叶片中叶绿素、硝酸盐和亚硝酸盐含量等指标。结果表明,喷施SNP 100μmol/L处理可促进芹菜种子萌发,加快幼苗期植株生长,提高幼苗生长量和叶片叶绿素含量;在快速生长期喷施SNP,除200μmol/L处理显著降低了植株株高和叶绿素含量外,其他浓度处理对生长量和叶绿素含量未产生显著影响;低浓度SNP增加了芹菜的侧根数目,改变了根系结构;利用HLPC法测定芹菜叶片中硝酸盐和亚硝酸盐含量的结果显示,外源SNP不会对芹菜叶片中硝酸盐和亚硝酸盐的累积产生显著影响。NO对芹菜生长发育的影响具有阶段特异性和组织特异性,适合于在其形态建成的早期应用;NO作为一种含氮的信号分子,不会改变芹菜与硝酸盐含量相关的食用品质。

水稻谷蛋白基因GluC启动子的克隆及表达分析

水稻谷蛋白仅在水稻种子胚乳中表达,其启动子是分离胚乳特异性表达启动子的理想材料。本研究克隆了GluC基因启动子pGluC,生物信息学分析表明pGluC内部含有胚乳特异性表达所需要的Skn-1 motif和ACGT-box元件。将pGluC启动子和7个5'端缺失启动子片段构建到p GPTV-GUS载体上,转化水稻愈伤组织,进行组织化学染色和GUS酶活分析。结果表明:全长及截短的-1 911、-1 611、-1 311 bp启动子均能驱动GUS基因在水稻种子胚乳中高效稳定表达。-999、-451、-203、-102 bp启动子失去了胚乳表达特异性,在根、茎或者叶中也检测到GUS表达。该结果为实现外源目的基因在水稻胚乳中特异高效表达提供了理论依据。