血管性血友病因子裂解酶CysR结构域生物学功能的研究

目的:研究血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13)富含半胱氨酸(CysR)结构域在血管性血友病因子(vWF)裂解中的生物学功能,为探明血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的发病机制提供实验证据。方法:利用点突变技术对ADAMTS13 CysR结构域中的EDGTLS氨基酸残基进行基因突变,制备质粒,表达并提纯蛋白。1%Sea Kem HGT琼脂糖凝胶分离后用Western blot方法观察野生型和突变型ADAMTS13在变性条件或剪切应力作用下对底物v WF的裂解活性。结果:成功构建了ADAMTS13突变体质粒(M1:Glu515Ala;M2:Asp516Ala;M3:Gly517Ala;M4:Thr518Ala;M5:Leu519Ala;M6:Ser520Al)。野生型和突变型ADAMTS13质粒在HEK293细胞中稳定表达,并提纯蛋白。在变性条件下,野生型ADAMTS13基本完全裂解了v WF多聚体,而突变体M1裂解v WF多聚体的活性显著降低(P <0.01)。在体外剪切应力作用下,与野生型ADAMTS13相比,突变体M1对v WF多聚体的裂解能力显著降低(P <0.01)。突变体M1对FRETS-vWF73的剪切能力与野生型ADAMTS13相比显著降低。与野生型ADAMTS13相比,突变体M1与v WF之间的结合力未见明显降低。结论:在变性条件和剪切应力作用下,ADAMTS13 CysR结构域在酶切v WF多聚体的过程中起着重要作用,其中Glu515可能是底物识别的重要作用位点。