海马神经干细胞不同传代方法的比较

背景:体外培养神经干细胞,在悬浮培养时由于自身增殖特性会形成球,传代时将会面临如何将细胞球分离成单细胞的问题。目的:寻求理想的大鼠海马神经干细胞传代方法,以获得大量可增生的神经干细胞以供研究。方法:分离新生1dSD大鼠海马神经干细胞,原代培养至五六天时,分别用机械吹打法、胰蛋白酶、TrypLE和Accutase消化法分离神经干细胞球。之后每7d传代1次,连续传代3次。分别于每次传代后第1天和传代后第4天计数活细胞比例和细胞球数目,实验重复3次。结果与结论:神经干细胞球经3种酶消化后获得的均是单细胞;经机械吹打后既有单个细胞,也有小细胞球分布于培养液中。在酶消化法中,Accutase消化法传代后神经干细胞的活细胞比例明显高于胰蛋白酶消化(P<0.01)和TrypLE消化法(P<0.05)。同时,Accutase消化法传代后新形成的细胞球数目也较其余各组多(P<0.01)。提示在实验条件下,Accutase消化法能够较好地将神经干细胞球分离成存活率较高、能快速形成新的克隆球的单个细胞,是较为理想的神经干细胞分离传代方法。

不同生长因子对人胚胎脑海马区神经干细胞体外生长的影响

本研究比较了不同生长因子对人胚胎脑海马区神经干细胞(NSCs)体外生长的影响.取胎龄8～12周的人胚胎脑海马,按基础培养液中生长因子的不同将培养细胞分为:h-EGF组、h-bFGF组、h-EGF+h-bFGF组、h-EGF+h-LIF组、h-bFGF+h-LIF组、h-EGF+h-bFGF+h-LIF组,将机械分离的单细胞悬液以2×106个细胞/ml接种到上述组别,观察各生长因子的作用.结果发现,原代细胞培养6 h时,各组细胞情形区别不大;随培养时间的延长,h-EGF+h-bFGF组和h-EGF+h-bFGF+h-LIF组先形成许多小细胞簇,7 d后,这两组的细胞球数量进一步增加;而h-bFGF+h-LIF组和h-EGF+h-LIF组有较少的细胞球,h-bFGF组偶见小细胞球,h-EGF组细胞几乎全部死亡.将培养的h-EGF+h-bFGF+h-LIF组的神经干细胞用1%FBS诱导分化后,行免疫细胞化学鉴定.结果表明,诱导分化12 h时,细胞呈RNA-结合蛋白(Musashil)阳性,7 d时,细胞大部分呈β-Ⅲ-管蛋白(β-Ⅲ-tu-bulin)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性,极少数为半乳糖脑苷脂(Galc)阳性.以上结果提示,人胚胎脑海马区NSCs的体外存活增殖必须依赖于h-EGF和h-bFGF的共同作用,而h-LIF对早期培养的人NSCs的影响不明显.

不同时间点人胚胎脑神经干细胞分化为神经元和胶质细胞比率的研究

目的 比较不同时间点人胚胎脑神经干细胞分化为神经元和胶质细胞的比例。方法 取胎龄8-12周的人胚胎脑海马，机械分离成单细胞悬液，以2×10^6个细胞／ml接种到含h-EGF、h-bFGF和h-LIF的DMEM／F12培养液中。用1％FBS诱导神经干细胞球分化，12h后行RNA．结合蛋白（musashil）免疫细胞化学鉴定，分别在2、5、7、14和23d时行β-Ⅲ微管蛋白（β-Tubulin／Tuj1）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）和半乳糖脑苷脂（gale）免疫细胞化学鉴定。结果 诱导分化12h时细胞球中绝大部分细胞为Musashil阳性细胞，第2d时有少量的β-ⅢTubulin和GFAP阳性细胞，未见galc阳性细胞；第7d时β-ⅢTubulin阳性细胞数目最多，约为细胞总数的48．2％，以后逐渐下降，而GFAP阳性细胞数目在第2—23d内呈逐渐增加趋势，到第23d时达细胞总数的65．3％；随分化时间延长，只能检测到极少量的galc阳性细胞。结论 1％FBS可促使人神经干细胞分化为中枢神经系统的3种主要细胞类型，且其分化为神经元和胶质细胞的比例在不同时间点上有显著差异。

不同分离方法对人胚胎脑海马区神经干细胞体外生长的影响

目的 比较不同分离方法对人胚胎脑海马区神经干细胞生长的影响。方法 取胎龄 8～ 12周药物流产的人胚胎脑 ,分别用胰蛋白酶消化法和机械分离法分离海马区细胞 ,均以 10 6个细胞 /ml接种到含人表皮生长因子 (h -EGF)、人碱性成纤维细胞生长因子 (h -bFGF)和人白细胞抑制因子 (h -LIF)的基础培养液中培养 ,以含1%胎牛血清 (FBS)的DMEM/F12和多聚鸟氨酸诱导分化 ,免疫细胞化学鉴定。结果 胰蛋白酶消化组和机械分离组分离到的活细胞分别占各自细胞总数的 4 8.2 %和 6 1.7% (P <0 .0 5 ) ;7天后 ,两组均形成许多直径从几十到几百个微米不等的细胞球 ,但机械分离组的细胞球数目明显多于胰蛋白酶消化组。取细胞球诱导分化及免疫细胞化学染色鉴定 ,细胞分别呈RNA -结合蛋白、β-Ⅲ管蛋白、胶质原纤维酸性蛋白和半乳糖脑苷脂免疫细胞化学反应阳性。结论 人胚胎脑海马区有神经干细胞存在 ,离体培养时能分裂增殖 ,并能被诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。机械分离法可以获得更多的活细胞 ,原代培养易形成较多的细胞球。

NR2A反义寡核苷酸对短暂性脑缺血/再灌注大鼠海马神经元损伤的保护作用

目的探讨NMDA受体亚单位2A(NR2A)反义寡核苷酸在短暂性脑缺血/再灌注大鼠海马神经元损伤中的保护作用,为研制和开发针对NR2A的特异性新药提供理论基础和形态学依据。方法健康♂SD大鼠随机分为正常对照组、假手术对照组和缺血/再灌注组。经生理盐水、错义寡核苷酸和反义寡核苷酸预处理后,以四血管阻断法建立短暂性全脑缺血(15min)/再灌注(1、2、3和5d)动物模型。在确定的时间点进行灌注固定、取材、石蜡包埋和组织切片(片厚8μm),然后行TUNEL反应、焦油紫染色、原位杂交染色以及免疫组织化学染色。结果短暂性脑缺血/再灌注(I/R)3d,大鼠海马CA1区出现大量的凋亡阳性细胞;I/R5d大鼠海马CA1区细胞严重受损,与对照组相比二组差异具有显著性(P<0.05)。经NR2A反义寡核苷酸预处理后,I/R3d和I/R5d海马CA1区的细胞凋亡和细胞损伤明显减轻,与对照组相比二组差异具有显著性(P<0.05)。NR2A反义寡核苷酸能抑制I/R1d NR2A mRNA表达和I/R2d蛋白质表达,与对照组相比差异具有显著性(P<0.05)。结论短暂性全脑缺血后,NR2A反义寡核苷酸能明显地减轻缺血诱导的大鼠海马CA1区细胞凋亡和细胞损伤,且这种作用与NR2A反义寡核苷酸特异性抑制NR2A及其mRNA的表达密切相关。

离体培养神经干细胞中NMDA受体亚单位NR2B的表达

目的研究离体培养的大鼠神经干细胞（NSCs）中N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体亚单位NR2B的表达。方法从孕18～19天胎鼠海马中分离、培养、传代、鉴定NSCs，用免疫细胞化学、Western blot免疫印迹检测传代1次NSCs中NMDA受体亚单位NR2B的表达。结果源自孕18～19天胎鼠海马的NSCs，即可以表达NMDA受体亚单位NR2B。结论体外培养的NSCs能表达NMDA受体亚单位NR2B。

转化生长因子β1对缺氧诱导的神经干细胞损伤的保护作用

目的:观察转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)对缺氧诱导的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)损伤是否具有保护作用。方法:取新生1 d的大鼠大脑皮质,进行NSCs的分离、培养、传代、诱导分化和鉴定。以三气培养箱(94%N2、5%CO2、1%O2)制备NSCs的缺氧损伤模型。取传代细胞,随机分为4组:正常对照组、三气缺氧组、溶剂对照组、生长因子组。各组细胞在相应时间点用Hoechst33258进行荧光染色,镜下观察、拍照,计算Hoechst染色阳性细胞率,评估三气培养对NSCs的损伤情况以及TGF-β1对这种损伤的保护作用。结果:在未诱导分化前,传代培养的细胞呈Nestin免疫反应阳性;用胎牛血清(fetal bovie serum,FBS)诱导分化后则分别呈Ⅲ型β-微管蛋白(typeⅢbeta tubulin,Ⅲβ-tubulin)和胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)免疫反应阳性,表明分离到的细胞是神经干细胞。Hoechst33258染色显示,凋亡细胞呈强亮蓝色荧光;正常细胞弥漫均匀着色,无强荧光。与正常对照组相比,三气缺氧组的凋亡阳性细胞显著增多(P<0.05)。与三气缺氧组或溶剂对照组相比,生长因子组的Hoechst33258染色凋亡阳性细胞数显著减少(P<0.05),但仍明显多于正常对照组(P<0.05)。结论:TGF-β1能够显著减少三气培养法所诱导的NSCs的凋亡,提示TGF-β1对NSCs的缺氧损伤具有重要的保护作用。为深入研究TGF-β1在NSCs的相关临床应用中的潜在价值提供理论基础和实验依据。

人胚胎脑海马区神经前体细胞移植到损伤的成年大鼠脑内存活及迁移的研究

本文从人胚胎脑海马区分离、培养、鉴定了神经前体细胞（neural precursor cells，NPCs），并初步观察了大鼠纹状体海人酸（kainic acid，KA）损伤后，人神经前体细胞（hNPCs）移植到成年大鼠侧脑室和纹状体后存活和迁移的情况。取胎龄8～12周的人胚胎脑海马区细胞，用含人表皮生长因子（human epidermal growth factor，h-EGF）、人碱性成纤维细胞生长因子（human basic fibroblast growth factor，h-bFGF）以及人白细胞抑制因子（human leukemia inhibitory growth factor，h-LIF）的DMEM／F12培养液离体培养，以含1％胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM／F12诱导分化，巢蛋白（nestin）免疫荧光染色鉴定NPCs的特征。向成年大鼠右侧纹状体内立体定位注射KA，造成大鼠纹状体局部损伤。用溴脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，BrdU）体外标记第2代hNPCs，48h后分别移植到正常成年大鼠和损伤大鼠手术侧的侧脑室和纹状体。6周后用抗BrdU抗体检测HNPCs的存活和迁移。结果显示：体外培养呈悬浮球状生长的细胞是nestin阳性的hNPCs。hNPCs移植6周后，在大鼠损伤侧的纹状体和侧脑室内，均检测到了BrdU阳性细胞，并有一部分细胞迁移到了周围纹状体实质和胼胝体。结果提示：体外分离培养的hNPCs移植到成年大鼠脑损伤区周围可以存活和迁移，损伤区域可能对移植细胞的迁移有一定的诱向作用。

人胚胎脑海马神经前体细胞的分离培养及形态学研究

目的 :从人胚胎脑海马区分离、培养并鉴定神经前体细胞 ,观察其形态学变化。方法 :取胎龄 8～ 12周人胚胎脑海马区细胞 ,用含人表皮生长因子 (h -EGF)、人碱性成纤维细胞生长因子 (h -bFGF)以及人白细胞抑制因子 (h -LIF)的DMEM F12培养液离体培养 ,以 1%胎牛血清 (FBS)和多聚赖氨酸诱导分化 ,倒置显微镜下测量形态指标 ,免疫细胞化学反应分析其神经化学性质。结果 :原代培养中 ,可见许多悬浮生长并渐增大的细胞球 ,以及很少数贴壁生长的成簇或单个细胞。将球吹打传代后 ,又有许多新的细胞球生成。取细胞球诱导分化 ,则见细胞从球迁出、伸出突起并渐分支 ,细胞分别 β -Ⅲtubulin、NF - 2 0 0、GFAP、Galc等免疫细胞化学反应阳性。 结论 :人胚胎脑海马区有神经前体细胞存在 ,离体培养时能分裂增殖和自我更新 ,并能被诱导分化为神经元前体细胞、神经细胞。

人胚胎脑海马区神经前体细胞移植到损伤的成年大鼠脑内存活及迁移的初步研究

本文从人胚胎脑海马区分离、培养、鉴定了神经前体细胞（neural precursor cells，NPCs），并初步观察了大鼠纹状体海人藻酸（kainic acid，KA）损伤后，人神经前体细胞（HNPCs）移植到成年大鼠侧脑室和纹状体后存活和迁移的情况。取胎龄8-12w的人胚胎脑海马区细胞，用含人表皮生长因子（human epidermal growth factor，h-EGF）

短暂性前脑缺血后大鼠海马各区NMDA受体亚单位NR2A和NR2B mRNA的表达变化

应用原位杂交组织化学和图像处理与分析的方法 ,观察短暂性前脑缺血 (15 m in)再灌注 (0 .5 h～ 7d)大鼠海马各区NR2 A和 NR2 B m RNA的表达变化 ,探讨二者在缺血性脑损伤中的作用。结果发现 ,缺血后 ,NR2 A和 NR2 B m RNA在海马各区呈现出一种相对一致的表达。在海马 CA1 区 ,NR2 A和 NR2 B m RNA的表达分别在缺血再灌 6h和 12 h降至低谷 (P<0 .0 5 ) ,然后表达开始回升 ,在缺血再灌 48h都升至高峰 (P<0 .0 5 ) ,之后表达再次下降 ,直至缺血后 7d(P<0 .0 5 ) ;在海马 CA3区 ,二者的表达变化规律与 CA1 区相似 ,不同的是表达变化的幅度明显减小。在齿状回 ,缺血后 0 .5 h～ 72 h,NR2 A和 NR2 B m RNA的表达未见显著性变化 ,72 h后表达开始下降 ,直至缺血后 7d(P<0 .0 5 )。以上结果提示 ,短暂性前脑缺血后 ,NR2 A和 NR2 B m R-NA在大鼠海马各区表达变化的模式不同 。

NMDA受体亚单位NR1、NR2A和NR2B在大鼠海马的免疫组织化学表达

目的 :观察N 甲基 D 门冬氨酸受体亚单位 1 (N methyl D aspartatereceptorsubunit 1 ,NR1 )、亚单位 2A(NR2A)和亚单位 2B(NR2B)在成年大鼠海马结构各区的表达特点 ,为研究三者在海马生理和病理过程中的作用提供形态学资料。方法 :大鼠脑 2 0 μm厚冰冻切片 ,免疫组织化学ABC法显色 ,图像分析。结果 :NR1、NR2A和NR2B在海马CA1～CA3区锥体细胞以及齿状回颗粒细胞普遍表达 ,三者中以NR1免疫组织化学反应最强 ,NR2A最弱 ,NR2B居中。NR1与NR2A在海马各区间的表达水平都无显著差异 ;NR2B在海马CA1区的表达明显强于其在CA3区及齿状回的表达 ,尤其是CA1区锥体细胞的顶树突在贯穿辐射层及腔隙分子层的全长中都呈高表达。结论 :NR1、NR2A和NR2B在正常海马结构各区的表达强度和形式存在差异 ,提示各区间天然N 甲基 D 门冬氨酸(N methyl D aspartate ,NMDA)

生后早期大鼠海马NMDA受体亚单位NR1、NR2A和NR2B的表达变化

运用免疫组织化学反应和图象分析处理技术研究生后 1d、4d、1周、2周、3周、4周、5周、6周的 SD大鼠海马结构中NMDA受体亚单位 NR1、NR2 A、NR2 B三种蛋白质的表达变化规律。结果表明 ,生后各时间点海马结构各区锥体细胞及颗粒细胞胞体中均有 NR1、NR2 A、NR2 B的表达 ,NR2 B还在锥体细胞的顶树突中有较强表达。 NR1与 NR2 B的生后表达变化模式相似 ,在生后 1d和 4d,两者在 CA3区的表达均高于 CA1 区 ;生后 1周后两者在 CA1 区的表达则高于 CA3区 ;到生后 2～ 3周其表达达到峰值。而 NR2 A却与此不同 ,生后 1d、4d时其在海马结构各区的表达较高 ,随发育时间延长表达逐渐下降 ,大约在生后 4周降至谷底。整个发育过程中 ,NR1在海马结构各区的表达始终高于 NR2 A和 NR2 B的表达。这些结果提示 ,生后早期大鼠海马结构 NR1、NR2 A、NR2 B的表达具有发育性时空差异和亚单位差异 ,这种差异可能与发育早期海马学习功能的特异性以及海马各区对缺血敏感性不同有关。

NMDA受体亚单位在海马脑片和在体发育海马结构中表达变化的比较

目的:对比长期培养大鼠海马脑片与在体生后发育海马结构中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚单位NR1、NR2A和NR2B表达变化的异同,为利用海马脑片研究NMDA受体亚单位在生理和病理状态中的作用提供资料。方法:免疫组织化学染色、海马脑片培养技术及图像分析。结果:NR1、NR2B在海马脑片各区和生后大鼠海马结构各区表达模式相似,均呈“先升后降”的趋势,但升降幅度不同;NR2A在海马脑片各区是“先升、后降”的趋势,在生后海马结构各区则呈现“先降后升”的模式。NR1、NR2A、NR2B在脑片和在体发育海马的相似期间,在CA1、CA3、PG区表达均无显著性差异。结论:P3w/C2w时NR1和NR2B在海马脑片各区的表达强度,和其在生后大鼠海马结构中的表达较相似。

NMDA受体亚单元NR2A和NR2B mRNA在缺血大鼠海马的表达及其与细胞凋亡的关系

目的 探讨短暂性前脑缺血后大鼠海马NR2A和NR2BmRNA的表达变化及其与海马缺血性细胞凋亡的关系。方法 四动脉阻断法建立脑缺血再灌注动物模型、原位杂交、TUNEL染色和图像分析与统计处理。 结果①缺血后 ,NR2A和NR2BmRNA在海马各区呈现出一种相对一致的表达规律。在CA1区 ,NR2A和NR2BmRNA的表达分别在缺血再灌 6h和 12h降至低谷 ,然后回升 ,在缺血再灌 4 8h都升至高峰 ,之后表达再次下降 ,直至缺血后 7d ;在CA3区 ,该变化规律依然存在 ,不同的是表达变化的幅度明显减小 ;而在齿状回 ,缺血再灌 0 .5～ 72h ,二者的表达未见显著性变化 ;72h后 ,表达下降 ,直至缺血后 7d。②缺血后 2 4h ,凋亡细胞出现 ,主要位于海马CA1区 ,进行性增多 ,4 8h增加更为明显 ,缺血后 72h达高峰 ;然后凋亡细胞有所减少 ,但至缺血后 7d ,依然存在。 结论 短暂性前脑缺血后 ,大鼠海马各区NR2A和NR2BmRNA的表达变化及细胞凋亡均存在着显著性差异 ;这种差异提示 ,缺血后 ,NR2A和NR2BmRNA的表达变化与海马的选择性易损现象和缺血性细胞凋亡之间可能存在着某种密切的关系。

离体培养海马脑片与在体发育海马结构形态学比较研究

目的 观察离体培养海马脑片与在体发育海马结构中锥体细胞和颗粒细胞的形态变化 ,比较两者间的差异 ,为海马脑片的应用提供形态学资料。方法 海马脑片培养技术 ,常规组织H -E染色及光镜下观察 ,体视学原理定量分析。结果 随着培养时间的延长 ,海马脑片阿蒙角锥体层数逐渐减少 ,CA1区和CA3区细胞的面数密度也逐渐减少 ,培养 2周 (C2w)时CA1区锥体细胞的面数密度高于在体发育 3周 (P3w)时锥体细胞的面数密度 ;齿状回颗粒细胞的面数密度渐增加 ,且齿状回颗粒细胞有从背侧支向腹侧支迁移的趋势。结论 离体培养海马脑片的发育与在体海马结构的发育模式相似 。

地佐环平对缺氧缺糖海马脑片CA1区Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达的影响

目的:观察N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体非竞争性拮抗剂MK-801对缺氧缺糖海马脑片CA1区Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达的影响。方法:新生6～9dSD大鼠断头取脑,制备海马脑片,将各孔脑片单纯随机分为3组,分别为正常对照组(HOTC)、单纯缺氧缺糖组(OGD)和预加MK-801再缺氧缺糖组(MK-801+OGD)。海马脑片进行缺氧缺糖培养,最后进行免疫组织化学染色和图像分析处理。结果:各组海马脑片CA1区均有不同程度Bcl-2,Bax蛋白表达。OGD组Bcl-2蛋白的表达(15.7±1.1)弱于HOTC组(18.5±0.9)和MK-801+OGD组(18.0±0.9),差异均有显著性意义(F=6.495,P<0.05);OGD组Bax蛋白的表达(13.1±2.5)强于HOTC组(7.3±1.1)和MK-801组(8.7±1.1),其差异均有显著性意义(F=9.770,P<0.05)。同时,OGD组CA1区出现细胞缺失形成的空洞,其他两组与OGD组相比有所减少。结论:MK-801可增强缺氧缺糖海马脑片CA1区Bcl-2蛋白的表达,降低Bax蛋白的表达,并减轻该区锥体细胞损伤程度。

一种经济实用的大鼠侧脑室置管方法

在中枢神经系统的动物实验中，理想的给药方法是先在动物的侧脑室埋植一套管，待动物从置管所引起的应激反应中恢复过来后，再从套管中给药，以避免应激反应对实验结果的影响。由于现在国内使用的套管几乎全部依赖进口，价格昂贵，大大限制了需要侧脑室置管实验的进行与推广。本着节约和创新的原则，

NMDA受体亚单位2A在大鼠海马缺血/再灌注损伤中的作用

目的观察NMDA受体亚单位2A(NR2A)特异性反义寡核苷酸阻断大鼠海马CA1区NR2A表达后在缺血性脑损伤中产生的变化,以揭示NR2A在缺血性脑损伤中的作用。方法健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组和缺血/再灌注组。分别经反义寡核苷酸、正义寡核苷酸、生理盐水对照和空白对照预处理后,以四血管阻断法建立短暂性前脑缺血(15min)/再灌注(24h和48h)动物模型。在确定的时间内进行灌注固定、取材、石蜡包埋和组织切片(片厚8μm),然后行原位杂交染色、TUNEL染色和焦油紫染色。结果缺血/再灌注早期(24h)大鼠海马CA1区NR2AmRNA的表达水平显著增高(P<0.05)。经反义寡核苷酸预处理后,大鼠海马CA1区NR2AmRNA的表达水平显著降低(P<0.05);同时TUNEL染色显示,在缺血/再灌注24h和48h凋亡阳性细胞的数量也明显降低(P<0.05)。结论短暂性前脑缺血后,NR2AmRNA的表达水平与细胞凋亡在时间上和空间上具有一致性,提示NR2A参与了脑缺血/再灌注诱导的细胞凋亡过程。