合成血红素加氧酶-1-shRNA载体的实验研究

根据Genebank提供的大鼠HO-1(Hmoxl,血红素加氧酶-1)基因序列,参照RNA干扰序列设计原则,设计针对HO-1的4个RNA干扰序列,定向克隆至表达载体pGPU6-GFP-Neo中,最后采用BamH I和Pst I酶切凝胶电泳鉴定。鉴定结果显示成功合成了荷载HO-1-shRNA的表达载体。

基质细胞衍生因子-1_α/CXCR4/CXCR7轴对骨髓间充质干细胞迁移的影响

目的探讨基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)受体CXCR4、CXCR7在骨髓间充质干细胞(BMSCs)中蛋白和mRNA的表达;及SDF-1α/CXCR4/CXCR7轴对BMSCs迁移作用的可能机制。方法体外培养大鼠BMSCs,流式细胞术鉴定细胞表面抗原CD29、CD44和CD34。应用CXCR4特异性拮抗剂AMD3100及CXCR7中和抗体分别阻断CXCR4及CXCR7,通过Western blotting和RT-PCR分别检测BMSCs蛋白和mRNA的表达变化;Transwell法检测细胞迁移能力。本次实验分为单纯BMSCs组(A)、AMD3100预处理BMSCs组(B)、CXCR7中和抗体预处理BMSCs组(C)及AMD3100+CXCR7中和抗体预处理BMSCs组(D)。结果经鉴定第3代大鼠BMSCs中CD29和CD44均呈阳性表达,而CD34表达阴性。BMSCs中CXCR4、CXCR7蛋白和mRNA均有表达。与A组相比,B组及D组CXCR4及CXCR7蛋白表达明显受到抑制(P<0.05),C组只有CXCR7蛋白表达降低(P<0.05);各组CXCR4 mRNA和CXCR7 mRNA的表达差异均无显著性。SDF-1α可以诱导BMSCs迁移,与0μg/L组相比,10μg/L组和100μg/L组穿膜细胞数均显著增多(P<0.01),与10μg/L组相比,100μg/L组穿膜细胞数亦明显增多(P<0.01);AMD3100和CXCR7中和抗体均能抑制BMSCs的迁移作用(P<0.05),当两者同时作用时,抑制效应更为显著(P<0.05)。结论 BMSCs共表达CXCR4、CXCR7蛋白及mRNA;BMSCs的迁移具有SDF-1α浓度依赖性;SDF-1α/CXCR4/CXCR7轴介导BMSCs的迁移作用,CXCR4受体和CXCR7受体对BMSCs的迁移可能具有协同促进作用。

基于W/O/W溶剂挥发复乳法的载药纳米微球合成及其作用研究

以乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、聚乙二醇(PEG)和乳铁蛋白(lactoferrin,Lf)为原料,采用复乳法制备荷载JNK3-shRNA表达质粒的纳米微球,同时制备空载纳米微球作为对照,将它们分别通过尾静脉注射至大鼠体内,采用HE染色法检测其对脑缺血再灌注后5天时海马CA1区神经元的保护作用,纳米微球Lf-PEG-PLGA/JNK3-shRNA构建成功,它能够显著提高神经元的存活率,在脑中风中,成功构建的Lf-PEG-PLGA/JNK3-shRNA纳米微球能够对神经元起到明显的保护作用。

杏仁核去5-HT支配小鼠抑郁样行为学变化与血清ACTH和TSH浓度的关系

目的观察小鼠双侧杏仁核去5-羟色胺（5-HT）支配后，在不同时程内所出现的抑郁样行为以及血清促肾上腺皮质激素（ACTH）和促甲状腺激素（TSH）浓度的变化，探讨杏仁核内的5-HT对下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴和下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴的调节以及与抑郁症的关系。方法双侧杏仁核定位注射5-HT能神经元的特异性损毁剂5，7-双羟色胺（5，7-DHT，DHT组）或生理盐水加维生素C（Vc，溶剂组），在不同时间点（术后1h、14天、21天）采血，用酶联免疫吸附法检测血清TSH和ACTH浓度。采用强迫游泳实验和悬尾实验检测小鼠抑郁样行为表现。结果与溶剂组相比，14天DHT组小鼠强迫游泳实验不动时间明显延长（P〈0．05），但21天时未见差异；14天DHT组和21天DHT组小鼠悬尾实验不动时间均明显延长（P〈0．05），21天显示差异具有极显著性（P〈0．01）；14天DHT组血清ACTH浓度显著降低（P〈0．01），至21天时较14天升高（P〈0．05），但未达到正常水平（P〈0．05）；14天DHT组血清TSH浓度显著降低（P〈0．05），至21天恢复到正常水平。结论杏仁核内5-HT浓度降低会引起小鼠抑郁样行为，并可能经HPA和HPT轴影响ACTH和TSH的分泌。经过代偿，部分激素水平可恢复，但抑郁症状并未完全消失。

小鼠双侧杏仁核去5-HT支配后的抑郁样行为学变化及杏仁核内FosB／△FosB的异常表达

目的探讨双侧杏仁核去5-羟色胺（5-HT）支配后小鼠的行为学变化，投射到杏仁核的5-HT能神经纤维的精确来源以及杏仁核神经元的异常功能活动，为验证杏仁核-中缝核群5-HT在抑郁症发病机制中的联系提供实验资料。方法雄性昆明小鼠32只，随机分为对照组和实验组，每组各16只，应用脑立体定位注射技术向双侧杏仁核注射5，7-双羟色胺（5，7-DHT，5μg／侧），悬尾实验和强迫游泳实验检测抑郁行为；脑石蜡切片H—E染色检测5-HT能投射神经元的位置；脑冰冻切片免疫组织化学染色检测杏仁核FosB／AFosB的表达。结果①行为学检测：实验组小鼠强迫游泳无动时间和悬尾无动时间较对照组显著减少（P〈0．01）；②H—E染色：实验组小鼠中缝背核尾侧份与中缝正中核嘴侧份的部分神经元胞体皱缩变形，胞质呈深紫伊红色染色，尼氏小体溶解或消失，胞核缩小或消失；③免疫组织化学染色：FosB／△FosB阳性神经元在实验组小鼠杏仁核明显增多，与对照组相比差异显著（P〈0．01）。结论杏仁核的5-HT能纤维投射主要来自中缝背核的尾侧和中缝正中核的嘴侧；单独的杏仁核去5-HT支配即可引发小鼠产生抑郁样行为；杏仁核内的即早基因FosB／△FosB在抑郁样行为形成的相关精神病理学机制中占有重要地位。

低剂量MK-801对小鼠焦虑、抑郁及学习记忆的影响

目的观察非竞争性NMDA受体拮抗剂地艹卓西平马来酸盐(MK-801)在低剂量时对小鼠焦虑、抑郁以及学习记忆能力的影响。方法将昆明小鼠随机分成对照组和MK-801组,采用高架十字迷宫、强迫游泳实验、悬尾实验、开场实验以及Morris水迷宫等方法,检测药物对小鼠行为的影响。结果与对照组相比,MK-801组抑郁模型中的不动时间减少(P<0.01);焦虑模型中在入开臂次数及停留时间的百分比增加(P<0.01),入臂总次数与总时间也增加;开场实验中运动能力增加(P<0.01);Morris水迷宫中小鼠学习记忆能力下降(P<0.01)。结论低剂量MK-801并未对小鼠产生抗焦虑以及抗抑郁的效果,但可降低学习记忆能力。

SDF-1α/CXCR7促进BMSCs向缺血/再灌注大鼠海马CA1区迁移

目的:研究基质细胞衍生因子-1α(stromal cell derived-factor-1α,SDF-1α)及其受体CXCR7在介导骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)向大鼠脑缺血区迁移的作用。方法:BMSCs的原代培养、四血管阻断脑缺血模型制备大鼠脑缺血模型、侧脑室移植组(培养基干预组、BMSCs组和CXCR7抗体预处理BMSCs组)、免疫组织化学和免疫荧光组织化学染色方法。结果:免疫组织化学染色结果显示:在各组大鼠海马CA1区细胞内可见不同程度的呈黄色或棕黄色颗粒的SDF-1α免疫阳性产物,主要表达在细胞胞质中,CXCR7蛋白则主要表达在胞核和胞膜中;与假手术组比较,BMSCs组和CXCR7抗体预处理BMSCs组SDF-1α和CXCR7的表达均升高(P<0.05)。免疫荧光组织化学结果显示:侧脑室注射BMSCs并移植48 h后,BMSCs组、CXCR7抗体预处理BMSCs组海马CA1区均有不同程度荧光标记的阳性细胞;与BMSCs组比较,CXCR7抗体预处理BMSCs组阳性细胞数降低(P<0.05)。结论:缺血/再灌注损伤后,促进了SDF-1α及CXCR7阳性产物的表达;同时SDF-1α/CXCR7能够促进BMSCs向损伤区域的迁移。

高剂量长时程金刚烷胺对小鼠行为学和脑内c-Fos表达的影响

目的 探讨临床高剂量长时程使用金刚烷胺 （amantadine,AMA） 治疗疾病时导致患者出现精神症状副作用的中枢机制.方法 雄性昆明小鼠,随机分成对照组和AMA组（每组n=20）.AMA组小鼠腹腔注射高剂量金刚烷胺 （60 mg/kg,qd×10天）,对照组小鼠注射等量生理盐水.在第9 天注射后20 min,分别用Sams-Dodd的刻板行为评分、自主活动观察和一次性被动回避反应 （OPAR） 对2组小鼠的行为学进行检测;在第10 天注射后2 h,用免疫组织化学法检测2组小鼠脑内c-Fos蛋白的表达.结果 ①AMA组小鼠刻板行为评分明显高于对照组 （P〈0.01）,尤以头部的背腹方向运动增多显著;②AMA组小鼠的自主行为活动明显少于对照组（P〈0.01）;③ AMA组小鼠的记忆能力较对照组明显下降（P〈0.01）;④AMA组小鼠在边缘皮质、海马、基底前脑、间脑的中线核和板内核、脑桥基底部以及延髓的外侧网状核等脑区c-Fos蛋白的表达数量明显高于对照组.结论 ①高剂量长时程AMA可致小鼠出现明显的精神分裂症样行为学变化,并影响了学习记忆功能;②与精神行为、情绪和内脏活动密切相关的前额皮质、扣带皮质、海马、杏仁核和隔外侧核等脑区的神经元功能活动明显改变,可能是高剂量长时程AMA导致出现精神病样副作用的解剖学基础.

神经粘附分子NCAM140基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的:构建有效的小鼠神经粘附分子(NCAM140)基因的RNA干扰(RNAi)质粒载体,为研究NCAM140参与的细胞信号通路转导、其生物学作用以及以NCAM140为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi质粒。方法:使用基因序列软件设计、筛选符合公开文献筛选参数的4条靶序列以及1条阴性对照序列,由上海吉玛技术有限公司合成。与载体质粒pGPU6/GFP/Neo重组后,分别命名为pSi-nca1、pSi-nca2、pSi-nca3、pSi-nca4和pSi-control。转染大肠杆菌感受态细胞。选择阳性克隆进行DNA测序鉴定,Western blot方法进行干扰靶点的筛选。选取干扰效率最高的质粒转染MN9D细胞,普通光学显微镜分别计数同一视野细胞总数及GFP阳性细胞数,计算转染效率。结果:酶切和DNA测序结果证实shRNA正确插入pGPU6/GFP/Neo质粒;Western blot结果显示与空质粒对照组比较,pSi-nca4组细胞NCAM140表达明显下调,细胞转染效率为62%。结论:成功构建靶向小鼠NCAM140基因的RNAi质粒,为NCAM140参与的细胞信号通路的研究以及以NCAM140为靶点的基因治疗提供了稳定转染细胞的干扰质粒,为研究其生物学作用奠定了分子生物学基础。

外源性H_2S通过激活K_(ATP)通道减轻大鼠胃缺血再灌注引起的胃黏膜损伤

本文旨在观察外源性硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)供体NaHS预处理对大鼠胃缺血再灌注(gastric ischemia-reperfusion,GI-R)损伤的影响及其可能的作用机制。实验分5组:假手术(sham)组、GI-R组、NaHS组、格列苯脲(glibenclamide)组和吡那地尔(pinacidil)组。采用夹闭雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠腹腔动脉30min再灌注1h,建立GI-R损伤模型。采用Adobe Photoshop软件分析计算GI-R引起的胃黏膜损伤面积,利用HE染色分析GI-R引起的胃黏膜损伤深度,通过比色法测定血浆中H2S的含量。结果显示,与假手术(sham)组相比,GI-R组胃黏膜损伤面积和损伤深度明显增加;NaHS预处理能够显著减小GI-R引起的胃黏膜损伤面积和损伤深度;但是NaHS预处理14d对血浆中的H2S浓度没有显著的影响。与NaHS预处理组相比,GI-R前给予ATP敏感K+通道(KATP)阻断剂格列苯脲和NaHS预处理,加重GI-R引起的胃黏膜损伤程度;与GI-R组相比,单独给予KATP通道开放剂吡那地尔能够抑制GI-R的损伤作用,保护胃黏膜。上述结果提示,外源性H2S通过开放KATP通道减轻GI-R引起的胃黏膜损伤,起到保护胃黏膜的作用。