PSA启动子调控并荷载hTERT-siRNAs的条件增殖型腺病毒的构建及生物学活性

目的构建前列腺特异抗原（PSA）启动子调控并荷载hTERT-siRNAs的条件增殖型腺病毒，研究其对前列腺癌的特异性抗肿瘤作用。方法EcoRV和Xba1分别酶切pZD55-hTERT-shRNA和pZXC2-PSA-E1A，将目的片段连接重组，获得质粒pPSA-ZD55-hTERT，将其与质粒pBHGE3共转染293细胞。PCR鉴定正确者即为条件增殖型腺病毒PSA-ZD55-hTERT。结晶紫染色观察其对前列腺癌细胞毒性。RT-PCR、Westernblot检测前列腺癌细胞中hTERT基因沉默效果。Westernblot检测E1A在前列腺癌细胞中的表达。结果成功构建PSA启动子调控并荷载hTERT-siRNAs的条件增殖型腺病毒PSA-ZD55-hTERT，初步证实PSA-ZD55-hTERT复制具有前列腺癌靶向性和特异的hTERT沉默效果。结论成功构建条件增殖型腺病毒PSA-ZD55-hTERT，为进一步体内外研究其对前列腺癌的治疗作用奠定基础。

PLCε对人骨肉瘤细胞迁移侵袭影响的实验研究

目的研究磷脂酶Cε(phospholipase C epsilon,PLCε)对人骨肉瘤细胞株U2OS迁移侵袭能力的影响。方法 siRNA干扰U2OS细胞PLCε的表达,应用CCK-8实验检测PLCε对细胞增殖能力的影响,以划痕实验、Transwell小室模型实验测定细胞迁移能力改变情况,以明胶酶谱实验测定细胞分泌基质金属蛋白酶MMP2的变化。结果体外合成特异性PLCε基因siRNA可明显抑制U2OS细胞中PLCε的表达;沉默PLCε后,U2OS细胞的增殖能力无明显变化,而划痕愈合能力、迁移活力较对照组细胞明显下降,其分泌MMP2的水平也明显下降。结论沉默PLCε可致人骨肉瘤细胞U2OS的迁移和侵袭能力下降。

SATB1与大肠癌侵袭转移关系的实验研究

目的探讨大肠癌组织中特异AT序列结合蛋白1（special AT—rich sequence binding protein，SATB1）的表达与大肠癌生物学行为的相关性。方法采用免疫组织化学方法检测39例大肠癌及相应癌旁对照组织中SATB1蛋白的表达；并分析其与临床病理特征的关系。结果SATB1蛋白在大肠癌组织中的表达水平与肿瘤浸润深度、TNM分期、淋巴结转移与远处转移有关（P〈0．05）。结论SATB1蛋白的表达水平增高可能与大肠癌的临床分期及其是否发生转移有关。

Ki67启动子调控的肿瘤增殖腺病毒对黑素瘤细胞的杀伤作用

目的:研究Ki67启动子调控增殖腺病毒Ki67-ZD55对黑素瘤A375细胞的杀伤作用。方法:将PBS、ZD55-EGFP和Ki67-ZD55分别作用于A375细胞。RT-PCR法检测Ki67-promoter mRNA的表达;荧光显微镜观察Ki67-ZD55增殖过程;MTT法检测细胞存活率;Western Blot法检测E1A蛋白及线粒体途径凋亡相关蛋白BAX、Bcl-XL、MCL-1和Caspase-3的表达。结果:RT-PCR检测结果显示Ki67-ZD55能够在A375细胞中表达Ki67-promoter序列;荧光显微镜观察结果显示Ki67-ZD55增殖明显;MTT结果表明Ki67-ZD55组对A375细胞的增殖具有明显抑制作用,抑制效果大于ZD55-EGFP组(P<0.05);Western Blot法检测结果表明E1A、BAX的表达量增加,Bcl-XL、MCL-1的表达量均降低,Procaspase-3发生了明显剪切。结论:Ki67-ZD55能够明显抑制A375细胞增殖,促进A375细胞凋亡。

金纳多注射液对肾缺血再灌注损伤诱导的PI3K/AKT及ASK1/p38信号通路的影响

目的研究银杏叶提取物金纳多(Ginaton)注射液防治肾脏缺血再灌注损伤及其分子机制。方法 SD大鼠随机分成假手术组、缺血再灌注组(肾I/R组)和药物组3个组。药物组术前连续3 d腹腔注射金纳多注射液(50 mg.kg-)1。采用双侧夹闭大鼠肾蒂的方法制备动物模型。观察肾功能、肾组织丙二醛(MDA)水平和肾脏病理改变。TUNEL及流式细胞术检测肾细胞凋亡。Western blot分析磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K/AKT),凋亡信号调节激酶1(ASK1);p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)的激活与表达。结果 (1)与假手术组相比,缺血再灌注组AKT、ASK1及p38MAPK的活性均明显增强,凋亡的细胞数量增加。(2)与缺血再灌注组相比,金纳多组大鼠的血清Scr、BUN、肾组织MDA水平、细胞凋亡百分率及凋亡细胞的数量均降低,差异有统计学意义(P<0.05);金纳多组AKT的活性显著增强,ASK1、p38的活性明显低于缺血再灌注组(P<0.05)。结论金纳多能抑制肾缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡,减轻肾组织病理及脂质过氧化损伤,改善缺血再灌注损伤。其作用机制与上调抗凋亡信号通路(PI3K)/AKT通路的激活,负调凋亡信号通路ASK1/p38通路的激活有密切关系。

一氧化氮对大鼠脑缺血再灌注后JNK3、Bad(ser128)和c-Jun磷酸化的影响

目的探讨一氧化氮对大鼠脑缺血再灌注后JNK3、Bad(ser128)和c-Jun磷酸化的影响。方法90只健康SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组(对照组)、硝普钠组、硝普钠+阻断剂组(阻断剂组)和溶剂组。以大鼠四动脉结扎脑缺血模型为基础,应用焦油紫染色法检测海马CA1区神经元凋亡,采用免疫印迹和免疫沉淀法检测JNK3、Bad(ser128)和c-Jun的磷酸化。结果硝普钠组脑海马CA1区神经元凋亡显著少于对照组、阻断剂组及溶剂组(P<0.05),对照组、阻断剂组及溶剂组之间差异无显著性(P>0.05);硝普钠组JNK3、Bad(ser128)和c-Jun的磷酸化显著低于对照组、阻断剂组及溶剂组(P<0.05),对照组、阻断剂组及溶剂组之间差异无显著性(P>0.05)。结论一氧化氮供体硝普钠能显著减轻脑缺血再灌注后脑海马CA1区神经元凋亡,明显抑制JNK3、Bad(ser128)和c-Jun的磷酸化水平,对脑缺血再灌注损伤起到保护作用。

构建STK11基因融合质粒检测其对肺癌细胞迁移能力的影响

目的构建表达STK11(serine/threonine kinase 11,STK11)基因和报告基因EGFP融合蛋白的重组质粒,并转染肺癌A549和H460细胞株,检测其对肺癌细胞迁移能力的影响。方法构建重组质粒pEGFP-STK11,双酶切和测序进行鉴定。重组质粒转染A549和H460细胞株,荧光显微镜观察EGFP蛋白表达情况,Western blot检测STK11蛋白表达情况,划痕实验检测其对肺癌细胞迁移能力的影响。结果酶切和测序结果表明pEGFP-STK11重组质粒构建成功;在转染A549和H460细胞后24h观察到绿色荧光最强;Western blot结果显示STK11蛋白在转染后24 h条带最深;划痕实验显示,转染组细胞迁移距离小于0.9%氯化钠溶液对照组(P<0.05)。结论成功构建STK11基因重组质粒,并能转染A549和H460细胞,转染后对肺癌细胞迁移能力起一定抑制作用。

种蛋部分物理性状对樱桃谷鸭孵化率的影响

通过测量樱桃谷鸭种蛋的主要物理性状指标即蛋形指数和蛋重,统计入孵蛋、受精蛋和孵化出壳蛋数,探讨了种蛋部分物理性状与孵化率的相关关系。结果表明,樱桃谷鸭的蛋形指数在0.72～0.77、蛋重在81.6～90.5 g范围内的孵化率较高。说明樱桃谷鸭种蛋的物理性状对孵化率有着重要的影响,过圆、过长、过重及过轻的种蛋都不宜入孵。

条件增殖型腺病毒PSA—ZD55-hTERT对人前列腺癌细胞移植瘤的抑制作用

目的探讨条件增殖型腺病毒PSA—ZD55-hTERT对人前列腺癌LNCaP细胞移植瘤端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达和肿瘤生长的抑制作用。方法建立人前列腺癌LNCaP细胞裸鼠移植瘤模型，瘤体内注射PSA—ZD55-hTERT，定期测量肿瘤体积，免疫荧光检测移植瘤组织中E1A及hTERT表达，原位末端标记法（TUNEL）检测肿瘤细胞凋亡。结果PSA—ZD55-hTERT能有效沉默hTERT基因，PSA—ZD55-hTERT组hTERT表达水平显著低于Ad—hTERT组、Ad—EGFP组及PBS组，差异显著；Ad—hTERT组、Ad—EGFP组及PBS组细胞凋亡阳性率分别为（49．7±5．1）％、（28．8±4．0）％和（2．8±2．4）％，而PSA—ZD55-hTERT细胞凋亡阳性率为（73．5±6．4）％，表明PSA—ZD55-hTERT能有效诱导肿瘤细胞凋亡；PSA—ZD55-hTERT接种7周后肿瘤体积为（131．5±28．2）mm^3，明显低于Ad—hTERT组[（469．2±74．3）mm^3]、Ad—EGFP组[（583．0±98．5）mm^3]和PBS组[（1547．5±196．4）mm^3]。结论PSA—ZD55-hTERT对裸鼠人前列腺癌LNCaP细胞移植瘤有显著的治疗效果，为治疗前列腺癌提供新的平台。

N-苄基甘氨酸乙酯的合成

[目的]考察N-苄基甘氨酸乙酯的合成工艺条件。[方法]以甘氨酸乙酯盐酸盐为原料,与氯化苄经N-烷基化反应合成N-苄基甘氨酸乙酯,研究反应温度、投料比、缚酸剂、溶剂等因素对试验结果的影响。[结果]优化工艺条件为:40℃反应4h,n(氯化苄):n(甘氨酸乙酯盐酸盐)为1.1∶1,三乙胺为缚酸剂,乙醇为溶剂,收率80.3%(以甘氨酸乙酯盐酸盐计),纯度98.0%(GC)以上。[结论]改进后的合成工艺操作简便,收率与纯度均较高,生产成本较低,为大规模生产N-苄基甘氨酸乙酯提供理论依据。

荷载hTERT基因double—shRNA溶瘤腺病毒对裸鼠人前列腺癌细胞移植瘤的抑制作用

目的探讨荷载人类端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）基因2个不同位点的shRNA的溶瘤腺病毒ZD55-double-hTERT对裸鼠人前列腺癌DU145细胞移植瘤生长的抑制作用。方法建立人前列腺癌DU145细胞移植瘤模型，瘤体内分别注射ZD55-double-hTERT、ZD55-hTERT1（荷载hTERT基因单个位点的shRNA的溶瘤腺病毒）、ZD55-hTERT2（荷载hTERT基因单个不同位点的shRNA的溶瘤腺病毒）和磷酸缓冲盐溶液（PBS），定期测量肿瘤体积，激光共聚焦和Western blot法检测移植瘤hTERT蛋白表达，原位末端标记法（TUNEL）检测肿瘤细胞凋亡。结果7周后各组肿瘤平均体积为：PBS组（1841.5±182.3）mm3，ZD55-hTERT1组（689.0±93.5）mm3,ZD55-hTERT2组（669.2±84.3）mm3,而ZD55-double-hTERT组仅为（237.5±26.2）mm3。ZD55-double-hTERT组与ZD55-hTERT1组、ZD55-hTERT2组之间差异显著（P＜0.01）。ZD55-double-hTERT对hTERT基因的沉默效果明显提高，hTERT蛋白检测荧光强弱依次为：ZD55-double-hTERT组＜ZD55-hTERT2组＜ZD55-hTERT1组＜PBS组。Western blot表明：ZD55-double-hTERT组、ZD55-hTERT1、ZD55-hTERT2和PBS中hTERT蛋白相对表达量为0.42±0.02、0.84±0.05、0.79±0.04和1.25±0.07，ZD55-double-hTERT组与其他各组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。TUNEL法结果显示：ZD55-double-hTERT处理组凋亡阳性率为（43.5±6.4）％，与ZD55-hTERT1组（24.2±3.1）％、ZD55-hTERT2组（28.8±3.0）％及PBS组（2.8±2.4）％相比明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论ZD55-double-hTERT能有效抑制裸鼠人前列腺癌DU145细胞移植瘤的生长，为治疗前列腺癌提供新的平台。

表达翻转重组酶的真核载体的构建

目的构建表达翻转重组酶（FLP）重组表达的真核载体。方法以质粒pFRT为模板，用聚合酶链反应（PCR）扩增出两端包含了Xbal和BamHI内切酶识别位点的全长FLP基因片段，将该片段插入用NheI和BamHI双酶切后的载体质粒pBK—CMV上，构建出重组质粒pBK—CMV—FLP。经过转化、挑选菌落，PCR鉴定且测序均正确。结果成功构建重组质粒pBK—CMV—FLP。结论构建好的pBK—CMV—FLP质粒为生物工程上删除筛选标记物提供了良好的条件。

奥曲肽对人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤凋亡的影响

目的探讨生长抑素类似物奥曲肽(OCT)对裸鼠人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤凋亡的影响。方法建立人肝癌细胞株BEL-7402裸鼠移植瘤模型,实验组皮下注射OCT100μg/kg.d-1,对照组给予相同容积的无菌生理盐水皮下注射,免疫组织化学染色检测OCT作用后裸鼠人肝癌BEL-7402组织中Bcl-2、Bax表达情况的改变,透射电镜观察OCT作用后裸鼠人肝癌BEL-7402组织超微结构的改变。结果 OCT作用后,移植瘤组织中凋亡抑制基因Bcl-2阳性表达率比对照组明显下降(P<0.05),凋亡促进基因Bax阳性表达率比对照组显著升高(P<0.05)。电镜下可见OCT组移植瘤细胞表面微绒毛减少或消失,凋亡细胞多见等改变。结论 OCT能引起人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤组织中凋亡基因Bcl-2及Bax的表达发生改变,诱导组织细胞发生凋亡;OCT能引起裸鼠人肝癌BEL-7402组织超微结构发生典型的凋亡改变。

Rap2c基因真核表达质粒的构建与表达

目的：为了探讨Rap2c基因与肺癌发生的关系，克隆人Ras家族小G蛋白Rap2c的cDNA，构建其真核表达质粒并在人肺癌细胞株A549和H1299中表达。方法人骨肉瘤细胞株U2OS提取细胞总RNA，经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）逆转录成cDNA，PCR扩增Rap2c，酶切后插入pcDNA3．1（＋）构建真核表达质粒 pcD-NA3．1（＋）-Rap2c，采用酶切及测序鉴定。重组质粒转染A 549和H 1299细胞，Western blot 检测其目的基因表达。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA3．1（＋）-Rap2c成功构建，Werstern blot 检测到 A549和H 1299细胞有相应蛋白表达。结论成功构建人Rap2c基因真核表达质粒，为后续研究奠定了基础。

DDR1的激活及其信号通路研究进展

盘状结构域受体（discoidin domain receptors,DDRs）是一类受体型酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases,RTKs）,可分为DDR1和DDR2,在细胞的黏附、增殖及细胞外基质的重塑中起重要作用.大量研究表明,DDR1及其信号通路在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用.本文对DDR1的激活及其相关信号转导通路的研究进展综述如下。

TIGIT在CIK细胞上的表达及对细胞增殖、凋亡的影响

目的 探讨TIGIT（T cell Ig and ITIM domain）在细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）上的表达及其对CIK细胞增殖、凋亡的影响.方法 分离肿瘤患者外周血单个核细胞（PBMCs）,体外诱导为CIK细胞,分别检测培养前的PBMC和培养第7、14天的CIK细胞的TIGIT表达.同时培养2组CIK细胞,实验组在常规CIK培养体系中加入TIGIT单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）封闭TIGIT的功能,对照组在常规培养CIK体系中加入鼠IgG1同型对照抗体,CFSE染色检测2组CIK细胞的增殖活性,Annexin V/7-AAD凋亡试剂盒检测2组CIK细胞的凋亡率.结果 PBMC和CIK细胞均表达TIGIT,TIGIT表达的多少可能和细胞活化状态有关.实验组CIK细胞增殖指数较对照组升高7％,组间差异具有统计学意义（P＜0.05）,2组间细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 封闭CIK细胞上的TIGIT可以扩大CIK细胞增殖,但不增加CIK细胞的凋亡.

外源性NO在细胞水平对GluR6 S-亚硝基化的作用

目的观察外源性一氧化氮（NO）供体硝普钠（SNP）和亚硝基谷胱甘肽（GSNO）在细胞水平对GluR6 S-亚硝基化的影响。方法将本事构建的pEGFP—GluR6质粒转染HEK293细胞24h后，加不恫浓度外源性NO供体SNP和GSNO处理30min后收集蛋白，用生物素转换法检测GluR6S—亚硝基化水平。结果给了不同浓度SNP时GluR6的s一亚硝基化均增高，并存给予1mmol／LSNP时其亚硝基化水平达最高。另外，给予200μmoL／L GSNO时GluR6的S-亚硝基化也增高。结论在过表达GIuR6的HEK293细胞中，外源性NO供体SNP和GSNO均能使GluR6 S-亚硝基化水平增高。结果提示，在体外，外源性NO能直接诱导GluR6 S-亚硝基化。

雷帕霉素联合紫杉醇对SGC-7901增殖影响的研究

目的:研究雷帕霉素联合紫杉醇对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。方法:MTT法检测经雷帕霉素、紫杉醇和雷帕霉素+紫杉醇作用后人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达,两因素析因设计方差分析法进行统计分析。结果:雷帕霉素、紫杉醇及雷帕霉素联合紫杉醇处理SGC-7901细胞后细胞增殖抑制率分别为(25.43±1.98)%、(27.28±3.34)%和(53.64±1.99)%,雷帕霉素或紫杉醇单独作用均可抑制细胞增殖,联合作用对细胞增殖抑制率影响极显著,F=57.471,P<0.001;两药联合指数>1.15,雷帕霉素和紫杉醇具有协同作用。雷帕霉素、紫杉醇及雷帕霉素联合紫杉醇处理SGC-7901细胞后细胞凋亡率分别为(16.25±1.86)%、(21.80±3.12)%和(38.60±3.78)%,雷帕霉素或紫杉醇单独作用均可诱导细胞凋亡,两药联用细胞凋亡率显著增加,P=0.016 3;雷帕霉素和紫杉醇具有协同诱导SGC-7901细胞凋亡作用。紫杉醇处理细胞后,HIF-1α及VEGF蛋白相对表达量分别为0.598±0.089和0.420±0.091,VEGF蛋白表达下降,P=0.001;而HIF-1α蛋白表达无明显变化,P=0.434。雷帕霉素处理细胞后,HIF-1α及VEGF蛋白相对表达量分别为0.416±0.034和0.376±0.022,表达均显著下降,P值分别为0.016和0.001;而两药联合处理细胞后,HIF-1α及VEGF蛋白相对表达分别为0.209±0.027和0.156±0.015,均显著降低,F值分别为18.322和25.525,P值均为0.001。2种药物对SGC-7901细胞HIF-1α及VEGF蛋白表达抑制起到了显著的协同作用。结论:雷帕霉素联合紫杉醇可显著抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖,诱导凋亡,2种药物具有协同抗肿瘤作用。

亚硒酸钠对肾缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡的影响

目的研究亚硒酸钠对肾缺血再灌注损伤诱导细胞凋亡的影响。方法18只SD大鼠随机分成3组,假手术组、缺血再灌注组和亚硒酸钠组。采用双侧夹闭大鼠肾蒂的方法制备动物模型,亚硒酸钠组大鼠术前连续3d腹腔注射亚硒酸钠(0.5mg·kg-1)。观察大鼠肾功能、肾脏病理改变,TUNEL及流式细胞术检测肾脏细胞凋亡情况,Western blot分析c-Jun N端蛋白激酶(JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)、原癌基因c-Jun(c-Jun)的激活和表达。结果缺血再灌注组大鼠血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平,细胞凋亡率及凋亡细胞数量,以及JNK、p38、c-Jun活性明显高于假手术组(P<0.01)。亚硒酸钠组大鼠血清Scr和BUN,细胞凋亡率,凋亡细胞数量,以及JNK、p38、c-Jun活性低于缺血再灌注组,差异有显著意义(P<0.05,P<0.01)。结论亚硒酸钠可能通过下调JNK、p38通路的激活,拮抗肾缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡,从而改善缺血再灌注损伤。

HL7702-HBX与HepG2-HBX细胞株的建立及鉴定

目的建立稳定、高效的HBx蛋白体外表达细胞株,以便进一步研究HBX基因和HBx蛋白的致癌作用及机理。方法建立HBX真核表达载体pcDNA3.1-HBX,通过脂质体介导将pcDNA3.1-HBX转染到人正常肝细胞株HL7702及人肝肿瘤细胞株HepG2中。结果 RT-PCR、蛋白质印迹及免疫荧光的实验结果显示,HBX基因在人正常肝细胞株HL7702及人肝肿瘤细胞株HepG2中得到了表达。结论成功构建了表达HBx蛋白的HL7702-HBX与HepG2-HBX细胞株,为进一步研究HBX基因和HBx蛋白的致癌作用及机制奠定了实验基础。