新生鼠和胎鼠海马神经干细胞分离和培养方法的比较

目的：探索大鼠海马神经于细胞离体培养的实验条件和方法，并建立一种简便且获得率较高的实验方法。方法：分别随机选取新生1—3dsD大鼠和孕18—19dSD胎鼠，并提取海马组织，采用机械吹打结合胰蛋白酶消化的方法获得单细胞悬液，然后对培养出的细胞进行鉴定和诱导分化，最后测定并分别比较两组原代细胞获得率和增殖率以及凋亡率之间的差异。结果：来源于两种不同发育阶段大鼠的海马组织培养出的细胞均呈Nestin阳性和BrdU阳性的神经球样结构，诱导分化后的细胞高表达βⅢ-tublin和GFAP。其中，胎鼠组原代细胞获得率较高、增殖能力较强，并有统计学差异（P〈0．05）；但两组神经干细胞的凋亡率无明显差异（P〉0．05）。结论：胎鼠和新生鼠海马组织均能培养出神经干细胞，而且胎鼠组细胞产出率更高。

银杏内酯B对戊四氮诱导的发育期癫痫大鼠海马内HIF-1α和Notch信号通路的影响

目的:探讨银杏内酯B(GKB)对癫痫大鼠海马中Notch-1与低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的影响。方法:21 d SD大鼠随机分为5组:生理盐水组(NS组)、戊四氮(PTZ)致癫痫持续状态(SE)模型组(PTZ组)、GKB治疗组(P+G组)、GKB治疗+Notch信号通路特异性抑制剂(DAPT)干预组(P+G+D组)、DAPT干预组(DAPT组)。1%PTZ(80 mg/kg)于大鼠腹腔注射诱导建立癫痫持续状态模型。建模前10 h大鼠海马注射DAPT(0.03 mg/kg),建模前30 min给予相关大鼠腹腔注射1 mg/ml GKB(5 mg/kg),各时间点未予药物组均给予等量生理盐水腹腔注射。NS、PTZ、P+G组建模后2、4、8、12、24、48和72 h,DAPT、P+G+D组建模后8 h分别取出大鼠海马组织,检测HIF-1α、Notch-1蛋白的含量和HIF-1α、Notch-1阳性细胞数的表达。结果:HIF-1α和Notch-1蛋白在NS组存在低水平表达,而且表达水平平稳;在PTZ组、P+G组存在明显的表达时程变化,2 h时表达开始上升,8 h表达达高峰,在各个时间点的表达与生理盐水比较差异明显(P<0.05)。在SE后8 h,PTZ组及P+G组大鼠海马内的HIF-1α和Notch-1蛋白表达水平和阳性细胞数表达较高,P+G组表达更高于PTZ组,而在DAPT处理后P+G组表达低于PTZ组(P<0.05)。结论:在癫痫持续状态后大鼠海马内的Notch和HIF-1α信号通路均被激活,银杏内酯B不仅进一步加强两个信号通路的表达,而且显示出Notch信号通路可能参与了海马内HIF-1α表达的调控。

发育期大鼠癫痫持续状态后海马内HIF-1α表达对Notch信号通路的影响

目的:探究发育期大鼠癫痫持续状态(SE)后海马内低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达对Notch信号通路的影响。方法:出生后21 d SD大鼠168只按随机数字表法分为对照组(NS,n=56)、模型组(SE,n=56)和干预组(2ME2,n=56)。其中SE组腹腔注射10 mg/ml戊四氮(PTZ,80 mg/kg)溶液制作癫痫持续状态模型,NS组腹腔注射等剂量生理盐水,2ME2组在癫痫持续状态模型建立后立即腹腔注射2-甲氧基雌二醇(2ME2,15 mg/kg)溶液。分别于造模成功后1、4、6、8、12 h和24 h处死大鼠取出海马组织,应用Western Blot方法检测HIF-1α、Notch-1蛋白含量;另外将各组造模成功后6 h的大鼠进行灌注并取脑,应用免疫组化染色法检测海马齿状回(DG)区HIF-1α和Notch-1的阳性细胞数。结果:HIF-1α、Notch-1蛋白在NS组均平稳表达;在SE组存在明显的表达时程和表达高峰,1 h时表达即开始增多,8 h达高峰,然后逐渐减少,且各个时间点的表达均明显高于NS组,差异有统计学意义(P<0.05);HIF-1α被特异性抑制剂2ME2干预后,HIF-1α、Notch-1的表达均较SE组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),其中6 h时达最低值。在此时间点,SE组HIF-1α、Notch-1的阳性细胞数均明显高于NS组和2ME2组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:发育期大鼠癫痫持续状态后HIF-1α可能部分参与了Notch信号通路的激活与调控。

癫痫持续状态大鼠海马内Notch通路对HIF-1α调控位点的研究

目的研究低氧诱导因子-1α(HIF-1α)及Notch信号通路下游基因HES1在发育期癫痫持续状态(SE)大鼠海马内的表达变化,探寻Notch信号通路对于HIF-1α的调控位点。方法 176只21日龄SD大鼠随机分为生理盐水对照组(NS组)、戊四氮(PTZ)致SE模型组(PTZ组)、Notch信号通路特异性抑制剂(DAPT)干预组(DAPT组)。PTZ组大鼠腹腔注射PTZ溶液制作SE模型,NS组注射等剂量的生理盐水作为对照,予安定腹腔注射终止SE发作。造模成功后分别于0.5、1、2、4、8 h断头取脑分离双侧海马组织,采用RT-PCR法检测HES 1、HIF-1αm RNA的表达;于2、4、8、12、24 h断头取海马,采用Western blot法检测蛋白的表达。DAPT组在开始造模前30 min腹腔注射DAPT溶液,分别于造模成功后2 h、8 h断头取海马组织,采用RT-PCR法检测2 h时HES1、HIF-1αm RNA的表达,用Western blot法检测8 h时蛋白的表达。结果 SE后的各个时间点,大鼠海马内HES1、HIF-1αm RNA和蛋白表达是增高的,与同一时间的NS组相比差异有统计学意义(P?<0.05);与同一时间点的PTZ组比较,DAPT组的HES1、HIF-1αm RNA和蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在发育期大鼠SE发作后的海马内,HES1基因可能是Notch信号通路中对HIF-1α表达的调控位点。

银杏内酯B对发育期癫痫大鼠海马中低氧诱导因子-1α及PI3K/Akt信号通路的影响

目的 了解银杏内酯B（GKB）对癫痫大鼠海马中低氧诱导因子-1α（HIF-1α）与磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）的影响,并探讨在这个过程中两者之间可能存在的关系.方法 21日龄SD大鼠96只随机分为5组：生理盐水组（NS组）、戊四氮（PTZ）致癫痫持续状态（SE）模型组（P组）、GKB治疗组（G＋P组）、GKB治疗＋PI3K抑制剂wortmannin干预组（G＋P＋W组）、wortmannin干预组（P＋W组）.于G＋P组建模后1h、4h、8h、24 h,其他组建模后4h、8h处死大鼠取出脑组织,应用免疫组化方法及Western blot检测HIF-1α、p-Akt蛋白的表达.结果 （1）G＋P组1h、4h、8h、24 h各时间点比较p-Akt蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.01）,4h表达达高峰（0.85±0.03）;同时各时间点的HIF-1α蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.01）,8h表达达高峰（1.00±0.13）.（2）8 h时间点各组间HIF-1α比较：NS组有少量表达,P组、G＋P组表达量较NS组均明显升高（P＜0.01）,且G＋P组表达量高于P组（P＜0.01）,G＋P＋W组、P＋W组表达量明显降低,但G＋P＋W组高于P＋W组（P＜0.01）.（3）4h时间点各组间p-Akt比较：NS组有少量表达,P组、G＋P组表达量较NS组均明显升高,且G＋P组表达量高于P组（P＜0.01）,G＋P＋W组、P＋W组表达量均明显降低.结论 在银杏内酯B作用下,癫痫持续状态大鼠海马内PI3K/Akt信号通路受到激活,并参与了海马内HIF-1α表达的调控.