微小RNA-221-3p通过DDIT4抑制镉诱导的TM3细胞凋亡机制

目的探讨微小RNA(microRNA,miRNA)中的miR-221-3p靶向DNA损伤诱导转录本4(DNA-damage-inducible transcript 4,DDIT4)对镉诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响和机制。方法小鼠睾丸间质细胞(mouse testicular stromal cells,TM3)经不同浓度的镉(0、10、20、30和40μmol/L)染毒后,使用CCK-8检测细胞活性。提取镉染毒TM3细胞的总RNA,以差异倍数(fold change,FC)>1.2,P<0.05作为标准筛选显著差异表达miRNA。TM3细胞分为空白对照组、阴性对照组、镉染毒组(CdCl2,20μmol/L)和镉染毒+miR-221-3p模拟物组,其中对镉染毒+miR-221-3p模拟物组,先将miR-221-3p模拟物转染进TM3细胞,再联合镉染毒24 h。Hoechst染色检测细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡率,实时荧光定量PCR和Western blot免疫印迹法检测DDIT4表达水平,双荧光素酶报告基因实验验证miR-221-3p与DDIT4的结合,生物信息学分析DDIT4的功能及与细胞凋亡的关联,过表达miR-221-3p后观察B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,BAX)的表达水平。结果镉染毒可降低TM3细胞活性且存在剂量-效应关系。细胞形态学发现,与对照组相比,镉染毒组细胞皱缩、细胞核浓染,凋亡率升至19.66%±0.45%(P<0.01);与镉染毒组相比,镉染毒+miR-221-3p模拟物组正常形态细胞增多,凋亡率降至13.76%±0.37%(P<0.05)。镉染毒组miR-221-3p表达水平下调(P<0.01),DDIT4表达水平上调(P<0.05)。生物信息学分析和双荧光素酶报告分析发现DDIT4为miR-221-3p的靶基因之一。与镉染毒组相比,镉染毒+miR-221-3p模拟物组DDIT4表达水平下调(P<0.05),Bcl-2/BAX比值由0.54±0.03增加为0.71±0.04。结论miR-221-3p通过靶向DDIT4进而抑制镉诱导的TM3细胞凋亡。

亚硒酸钠与纳米硒对镉致小鼠睾丸间质细胞毒性的干预作用

目的 比较亚硒酸钠(Se)和纳米硒(Nano-Se)对镉(Cd)致小鼠睾丸间质细胞毒性的干预作用。方法将小鼠睾丸间质细胞分成四组,分别是对照组、镉染毒组(Cd20μmol/L)、硒+镉染毒组(Se+Cd)、纳米硒+镉染毒组(Nano-Se+Cd),每组至少3个样本,重复3次以上。CCK-8检测细胞活性,Hoechst染色检测细胞凋亡形态变化,流式细胞仪分析细胞凋亡率,Westernblot测定蛋白的相对表达含量。结果 与Cd染毒组比较,Se组和Nano-Se组细胞活性明显上升(P<0.01);当Se和Nano-Se的浓度达20μmol/L时,Se组和Nano-Se组细胞活性最高(P<0.01),且Nano-Se与相同浓度的Se比较,Nano-Se组的细胞活性较高(P<0.01)。细胞形态观察发现,Cd染毒组细胞皱缩变圆,体积变小,细胞间距变大,荧光染色细胞核染色较多;与Cd染毒组比较,Se组和Nano-Se组生长形态较好,荧光染色细胞核染色较少,Nano-Se组比Se组生长情况更佳。Cd染毒组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01),而与Cd染毒组比较,Se组和Nano-Se组细胞凋亡率明显降低(P<0.01);且与Se组比较,Nano-Se组细胞凋亡率更低(P<0.01)。与对照组比较,Cd染毒组TM3细胞Bax/Bcl-2比值明显增大(P<0.01);与Se组比较,Nano-Se组的Bax/Bcl-2比值更低(P<0.05)。结论 Nano-Se与Se比较对Cd致TM3细胞毒性干预作用更好,可能与Nano-Se能更好抑制镉引起的TM3细胞凋亡有关。

miRNA转录组学分析镉致小鼠睾丸间质细胞毒性作用机制

目的运用转录组测序及生物信息学技术,探讨镉通过调控微小RNA(microRNA,miRNA)引起小鼠睾丸间质细胞(TM3)毒性的机制。方法选取TM3为细胞模型,分为对照组(不予镉处理)和镉染毒组(20μmol/L CdCl_(2)),24 h后收获细胞提取总RNA,通过RNA质量检测后上机执行测序程序得到miRNA的表达谱。以差异倍数(fold change,FC)>2,P<0.05作为标准筛选显著差异表达miRNA,并采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)对差异表达miRNA进行验证。同时,利用miRanda软件预测其靶基因,构建miRNA-靶基因互作网络并对靶基因进行基因本体学(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)功能富集分析。结果筛选出镉致TM3细胞毒性相关的26个显著差异表达miRNA,其中19个显著上调,7个显著下调。qRT-PCR对其中3个差异miRNA进行表达量的验证,结果与转录组测序相一致。生物信息学分析结果显示:26个差异表达miRNA共预测到657个靶基因,GO富集主要归类于生物调控、代谢过程、蛋白结合和催化活性等方面;KEGG通路注释表明靶基因主要富集于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)等与炎症反应、细胞凋亡密切相关的经典信号通路(P<0.05)。结论镉可导致TM3细胞差异表达miRNA,其靶基因可能通过MAPK、TNF等信号通路参与镉引起的TM3细胞毒性。

Nano-Se对镉致睾丸间质细胞凋亡保护作用的研究

目的探究纳米硒(nano-selenium,Nano-Se)通过调节Bax/Bcl-2比值对镉(cadmium,Cd)致小鼠睾丸间质细胞(TM3)凋亡的保护作用。方法试验分为5组,即对照组、镉染毒组、低剂量纳米硒组、中剂量纳米硒组和高剂量纳米硒组。其中镉染毒剂量为20μmol/L;纳米硒处理剂量分别为5、10和20μmol/L。采用CCK-8检测细胞活力,Hoechst染色检测凋亡,通过Western Blot检测Bax和Bcl-2蛋白的表达以及Bax/Bcl-2比值的变化情况。结果:与对照组相比,Cd能使TM3细胞形态改变,造成细胞损伤,导致细胞活力明显下降(P<0.05),使Bax/Bcl-2比值明显升高(P<0.05)诱发TM3细胞凋亡。而与Cd组相比,Nano-Se能够抑制Cd对TM3细胞的毒性作用,提高细胞活力(P<0.05),降低Bax/Bcl-2比值(P<0.05)和TM3细胞的凋亡水平。结论 Nano-Se对Cd致TM3细胞毒性损伤具有保护作用,可能降低TM3细胞中Bax/Bcl-2比值,从而抑制TM3细胞凋亡。

N-乙酰半胱氨酸激活蛋白激酶B通路减轻镉诱导的睾丸间质细胞凋亡

目的探究N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)基于蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称AKT)通路对镉诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡的调控机制。方法将小鼠睾丸间质细胞(TM3)分为对照组、镉染毒组(Cd,5、10、20、30、40和50μmol/L)、NAC组(NAC,500μmol/L)及NAC+镉染毒组(500μmol/L NAC+20μmol/L Cd),其中NAC+Cd染毒组先用NAC预处理30 min,再联合镉染毒24 h。CCK8测定细胞存活率,Hoechst染色检测细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡率,同时测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,Western blot免疫印迹法分别检测AKT蛋白、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)的表达水平。结果镉可抑制TM3细胞增殖且存在剂量-效应关系。细胞形态观察发现,随着镉染毒浓度的增加,细胞缩小变圆甚至脱落,核致密浓染;NAC预处理可明显改善镉对TM3细胞的损伤,浓染细胞明显减少。镉染毒组的MDA含量为(1.56±0.11)μmol/mg prot,较对照组显著升高(P<0.01),GSH水平为(1.28±0.25)μmol/mg prot,明显低于对照组(P<0.01);NAC预处理可降低细胞内MDA含量,提高GSH水平,与镉染毒组相比,差异有统计学意义(P<0.01);Western blot结果显示,NAC+Cd组磷酸化AKT蛋白和Bcl-2蛋白表达水平分别为0.65±0.05和0.45±0.03,均显著高于Cd染毒组(P<0.01),并且Bax/Bcl-2比值为1.54±0.15,较镉染毒组显著降低(P<0.01)。结论NAC可抑制镉诱导的TM3细胞损伤及其凋亡,可能与NAC改善细胞氧化应激状态,激活TM3细胞AKT通路和降低Bax/Bcl-2比值有关。