纳米纤维支架表面共培养HUVECs对人和大鼠MSCs成骨/血管分化的影响研究

目的研究在纳米纤维表面共培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)对人和大鼠骨髓间充质干细胞(human and rat bone marrow mesenchymal stem cells,hMSCs and rMSCs)向成骨,成血管分化的影响,为骨组织工程血管化及骨快速修复提供方法。方法将聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]静电纺丝纳米纤维进行氨气等离子体处理来接枝氨基基团,用扫描电子显微镜(scanning electronic microscopy,SEM)观察处理前后纤维形貌变化及直径分布;将HUVECs与hMSCs和rMSCs共培养(hMIX,rMIX)于修饰前后的PLGA纳米纤维表面,在培养1,3(4),7 d后用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖,培养14 d后CD31免疫荧光染色检测成血管分化情况,培养21 d后茜素红S(alizarin red S,ARS)染色钙结节检测成骨分化情况。结果SEM形貌观察结果显示经氨气等离子体处理后PLGA纳米纤维的直径及粗糙度略有增加;CCK-8结果显示氨基修饰后的纳米纤维表面更有利于rMIX的黏附和增殖,而对于hMIX的黏附和增殖影响很小;ARS染色结果显示氨基修饰的表面可以促进rMSCs成骨分化,而对hMSCs影响不大;CD31染色结果显示,HUVECs共培养及氨基修饰纳米纤维可以促进hMSCs成血管分化,而对rMSCs成血管分化没有促进作用。结论氨基修饰的纳米纤维表面培养hMSCs-HUVECs可以有效促进组织工程骨血管化,在骨组织工程中有一定的应用前景。

压力刺激对组织工程骨替代物构建的促进作用研究

目的:构建仿生三维多孔支架-细胞复合物,探讨压力刺激对其成骨作用的影响。方法:用颗粒沥滤法制备聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)三维多孔支架,与人骨髓间充质干细胞(hMSCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养,形成支架-细胞复合物,用PKH26染料对hMSCs进行细胞膜染色示踪,在第1、3、7天用激光共聚焦显微镜观察,在第3、5、7、9天用CCK-8试剂盒分别检测细胞增殖情况;培养10 d后将此复合物置于压力型生物反应器中进行压力刺激,检测其成骨及血管化情况;然后将压力刺激后的复合物植入鸡尿囊胚模型(CAM)中,7 d后取出,用micro-CT检测其成骨情况。结果:细胞示踪及CCK-8检测显示细胞增殖良好; micro-CT结果显示压力刺激后矿化显著增多,但总量较少; CD31免疫荧光染色结果显示压力刺激对血管生成作用不明显; CAM实验显示,压力刺激后的支架-细胞复合物对于体内骨生成有显著促进作用。结论:构建的支架-细胞复合物在压力刺激下可以快速骨化,是一种有应用潜力的组织工程骨替代物。

肠道与肺中ILC2细胞不同免疫反应特性研究

目的:探讨肠道与肺中固有淋巴细胞2(innate lymphoid cell2,ILC2)的不同免疫反应特性。方法:使用real-time PCR检测肠道和肺中ILC2细胞转录因子及细胞因子的表达;EdU方法检测肠道和肺中ILC2细胞对不同细胞因子刺激的增殖反应;观察Notch信号抑制剂GSI对肠道和肺中ILC2细胞体外增殖的影响。结果:与肺ILC2细胞相比,肠道ILC2细胞IL-13、IL-17、IFN-γ及IL-25受体IL17RB表达显著升高,而IL-5、IL-33受体IL1RL1显著降低。IL-25能显著提高肠道ILC2体外增殖能力;GSI抑制Notch信号后显著降低IL-25促进肠道ILC2体外增殖能力。结论:肠道与肺中ILC2表达不同的细胞因子,依赖于IL-25的肠道ILC2增殖能力受Notch信号影响。

可注射胶原水凝胶复合间充质干细胞在骨组织工程中的应用研究

目的构建水凝胶干细胞复合支架,探讨其在骨组织工程中的应用。方法制备胶原水凝胶与人骨髓间充质干细胞(h MSCs)复合物,并与不同浓度人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养(分3组:h MSCs∶HUVECs=10∶0,h MSCs∶HUVECs=5∶5,h MSCs∶HUVECs=9∶1),对其进行Live&Dead染色检测水凝胶的细胞相容性,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,并用碱性磷酸酶检测试剂盒(BCIP/NBT)和茜素红S染色来评估h MSCs在水凝胶支架中的成骨分化情况。结果胶原水凝胶具有很好的细胞相容性,Live&Dead染色结果显示死亡细胞较少,CCK-8试剂盒检测结果显示3组细胞在水凝胶中均有很好的增殖能力,BCIP/NBT和ARS检测结果显示10%和50%含量的HUVECs均可以促进h MSCs成骨分化。结论复合h MSCs和HUVECs的胶原水凝胶具有良好的成骨作用,有望用于骨缺损治疗。

IL-33通过ST2改变MDSC功能参与MCMV肺炎

目的:探讨白细胞介素-33(interleukin-33,IL-33)对鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)肺炎的影响。方法:通过分子生物学的方法构建IL-33原核表达载体纯化并鉴定纯化产物;通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法鉴定IL-33受体ST2^-/-小鼠的基因型;通过鼻腔感染MCMV建立小鼠肺炎模型,并通过病理学评价肺炎模型及与IL-33的相关性;野生型及ST2^-/-小鼠尾静脉注射外源性IL-33蛋白后,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)检测小鼠肺中IL-33蛋白变化情况,病理学比较肺炎模型的严重程度,空斑实验比较肺部病毒载量程度;流式细胞术检测2种小鼠骨髓原性的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)细胞的ST2表达情况及MDSC细胞在肺中的比例;实时定量聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)检测肺中MDSC发挥抑制功能相关的的精氨酸酶-1(Arginase-1)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和Th2型细胞因子。结果:成功构建IL-33原核表达载体并通过SDS-PAGE和Western Blot方法验证;PCR成功鉴定并区分野生型及ST2^-/-型小鼠;通过病理学检测成功建立鼻腔感染MCMV肺炎模型,肺炎模型组IL-33 mRNA和蛋白含量显著高于对照组;野生型小鼠尾静脉注射IL-33蛋白后,第7天肺炎病理学表现最严重,肺病毒载量最高;ST2^-/-小鼠尾静脉注射IL-33蛋白后,与野生型小鼠相比,肺炎病理学表现严重程度及病毒载量显著降低;外源加入IL-33蛋白后,Arginase-1、iNOS及Th2型细胞因子显著升高。结论:IL-33可以通过活化肺中MDSC细胞促进MCMV肺炎。

PGAM5对食管癌细胞系增殖与转移能力的影响

目的体外实验探讨PGAM5基因对食管癌细胞系KYSE150增殖与转移能力的影响。方法通过Western Blotting法比较人正常食管上皮细胞系HEEC和人食管癌细胞系KYSE150中PGAM5蛋白表达水平;分别将对照siRNA(siCtrl)和PGAM5特异的siRNA(siPGAM5)导入KYSE150细胞系,Western Blotting法检测沉默PGAM5对抗凋亡基因Bcl-xL和迁移相关基因MMP2表达水平的影响;通过CCK8方法检测沉默PGAM5对细胞增殖的影响;流式细胞术检测对细胞凋亡的影响;划痕实验和Transwell实验检测对细胞迁移和侵袭能力的影响。结果 HEEC细胞系PGAM5蛋白表达水平显著低于KYSE150细胞系;siPGAM5转染KYSE150细胞系后Bcl-xL和MMP2蛋白表达水平显著降低;干扰PGAM5后KYSE150细胞的增殖能力显著降低,凋亡能力显著升高,同时细胞的迁移和侵袭能力显著降低。结论干扰PGAM5可以抑制人食管癌细胞系KYSE150的增殖和转移能力。

微课在医学免疫学教学中的应用

主要以近年新兴教学手段微课为例,分析医学免疫学这门医学基础学科在教学过程中运用新兴教学手段,激发学生学习热情,探讨将高校课堂枯燥乏味的医学免疫学知识点,生动形象的传授给学生。

缺氧对骨髓源性抑制性细胞向肿瘤相关巨噬细胞分化的影响

目的探讨缺氧条件下糖代谢对骨髓源性抑制性细胞(MDSCs)向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)分化的影响。方法采用流式细胞术选出MDSCs,Western blot法检测缺氧或非缺氧条件下MDSCs中缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、信号转导与转录激活因子3(STAT3)的蛋白表达。缺氧条件下加入HIF-1α抑制剂LW6 20μmol/L、2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)0.5、5 mmol/L或寡霉素A 0.5 mmol/L后,采用流式细胞术观察MDSCs向巨噬细胞体外分化的情况。采用流式细胞术、RT-PCR和ELISA法检测MDSCs分化的细胞具有TAM特征的情况。结果与非缺氧条件相比,缺氧条件下HIF-1α蛋白表达、MDSCs向巨噬细胞分化的比例增加(P<0.05),STAT3蛋白表达降低(P<0.05);而加入HIF-1α抑制剂LW6可逆转上述各指标的变化过程(P<0.05)。2-DG 5 mmol/L和寡霉素A 0.5 mmol/L可下调缺氧条件下MDSCs向巨噬细胞分化(P<0.05)。在缺氧条件下,MDSCs分化的巨噬细胞特征为CD206阳性、Arg-1基因表达升高以及分泌的IL-10含量增加(P<0.05),具有显著的TAM特征。结论在缺氧条件下,MDSCs可能通过上调HIF-1α的表达促进糖酵解作用,进而促使其向TAM分化。

氨基修饰的纳米纤维对人和大鼠MSCs增殖分化的影响

目的:探讨氨基修饰后的静电纺丝纳米纤维对大鼠和人骨髓来源的间充质干细胞(Rat and human bone marrow mesenchymal stem cells, r MSCs and hMSCs)增殖及成骨分化的影响。方法:采用静电纺丝法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)纳米纤维,用氨气等离子体处理其表面来接枝氨基;通过测量PLGA纳米纤维(NF)及氨基修饰后的纳米纤维(NF-NH_2)接触角来证明修饰效果;将r MSCs和hMSCs分别接种于NF和NF-NH_2,用CCK-8试剂盒检测接种后1, 3 (4), 7天的细胞增殖;接种后的21天,用茜素红S染色(ARS)法检测细胞成骨分化情况。结果:氨气等离子体处理后纳米纤维接触角从81.28±0.33降低至53.99±0.79,说明氨基修饰后的PLGA NF亲水性增加;CCK-8结果显示氨基修饰增加了r MSCs的黏附,接种24 h后r MSCs在NF和NF-NH_2上的检测吸光值分别为0.096±0.011和0.175±0.014(P<0.001),而对hMSCs黏附和增殖没有影响,接种24 h后hMSCs在NF和NF-NH_2上的检测吸光值分别为0.237±0.004和0.238±0.006(P>0.05);ARS染色结果显示氨基修饰后r MSCs成骨分化增多(在NF和NF-NH_2表面ARS染色区域比例分别13.147±3.223%和36.677±5.230%),而hMSCs在修饰前后的纳米纤维上均有表达(修饰前后ARS染色比例分别为50.283±2.942%和38.254±3.272%)。结论:氨基修饰的NF可以促进大鼠来源的MSCs黏附增殖以及成骨分化,而对人骨髓来源的MSCs没有显著影响,这提示我们MSCs的增殖分化行为可能具有种属依赖性。