高效毛细管电泳法测定发酵液中林可霉素的含量

应用高效毛细管电泳法对发酵液中的林可霉素的含量进行了测定,研究了检测波长、缓冲液的种类、pH值、浓度以及分离电压等对测定结果的影响。结果表明,在pH 8.5的60 mmol/L的硼酸-SDS缓冲液,20 kV分离电压下,林可霉素的测定效果最佳,线性关系、精密度、稳定性及加样回收率符合要求。本方法简便、快速、准确,适用于含有林可霉素发酵液样品的检测。

黑曲霉固态发酵产柚苷酶培养基的优化

以黑曲霉(Aspergillus niger)为柚苷酶生产菌株,进行固态发酵生产柚苷酶.首先采用单因素实验对发酵培养基的固液比、氮源、无机盐及诱导底物柚皮粉的加入量进行初步优化,再通过正交试验确定了黑曲霉固态发酵产柚苷酶最优培养基的组成.实验结果表明:在500mL三角瓶中,麸皮与柚皮粉加入总质量为5.5g,其中,柚皮粉的加入量为2.0g,培养基固液比为1∶2.5,(NH_4)_2SO_4加入量为0.5g,MgSO_4加入量为0.03g.通过优化后的培养基进行固态发酵产柚苷酶的研究,发酵144h酶活达到最大为1248.0U/g,比优化前的基础培养基(377.6U/g)提高了2.3倍.

三相法提取猪肝酯酶及其在制备D -7-ACA中的应用

酯酶广泛存在于动物、植物和微生物中,具有作用范围广、底物特异性高等特点。该酶能够催化许多含有酯、酰胺、硫酯或乙酰基的化合物的水解与合成,在生物催化领域具有重要的用途。对来源于猪肝中的酯酶采用三相分离的方法进行了提取,并利用猪肝酯酶的水解特性,研究了其催化7-氨基头孢烷酸(7-ACA)脱乙酰基制备去乙酰基-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)的过程。主要研究结果:确立了三相法分离提取猪肝酯酶的方法,考察了有机溶剂种类、有机溶剂用量、硫酸铵浓度以及体系的pH和提取温度等条件对三相法分离提取猪肝酯酶的影响。实验结果表明在硫酸铵质量分数为45%、异丁醇与水相之比为1∶1、pH7.0、温度为30℃的条件下,酶活回收率为54.84%,纯化倍数为6.32倍。以猪肝酯酶为催化剂,研究了猪肝酯酶催化7-ACA脱乙酰基制备D-7-ACA,在pH7.5、温度35℃、底物浓度2%、酶添加量30 U/mL的反应条件下,7-ACA转化率达到94.33%。

费氏链霉菌脱氢酶NeoE的生物信息学分析及其对产新霉素的影响

目的NeoE是费氏链霉菌合成新霉素途径中一种重要的NAD(P)+依赖性脱氢酶,本研究的目的是预测其生物学性质及其对新霉素合成能力的影响。方法由NCBI网站蛋白质数据库获得NeoE氨基酸序列,利用生物信息学网站及软件分析预测其特征。随后构建neoE过表达质粒,以接合转移方式得到高产重组菌株SF-neoE。最后经摇瓶发酵以及相关基因的转录分析探究NeoE对新霉素生物合成的影响。结果NeoE由340个氨基酸组成,理论相对分子质量约为35228.33 Da,理论pI值5.14,不存在信号肽和跨膜区,是一个疏水性的稳定胞内蛋白。对含空载质粒菌株和重组菌株摇瓶发酵与RT-qPCR分析,结果表明第48小时neoE的相对表达水平较对照菌株提高了2.1倍,且NeoE的过量表达使得新霉素效价提高42%。结论该结果为提高新霉素效价提供思路,并为后续定向改造NeoE探究其对费氏链霉菌生长代谢的影响奠定理论基础。

交联酶聚集体转化葡萄糖制备葡萄糖酸的研究

共交联葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶具有较好的耐酸性,可以直接转化葡萄糖制备葡萄糖酸。利用正交实验优化其转化条件:反应温度为31℃,转速为150 r/min,加酶质量分数为2.0%,底物质量浓度为150 g/L。发酵罐放大实验显示其转化率可以达到97.2%,并且交联酶的稳定性较好,可以有效的连续使用3个批次,平均转化率为93.8%。利用葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶共交联聚集体制备葡萄糖酸是一种简便、高效的方法。

栓菌Trametes sp.LS-10C半固态发酵漆酶对吲哚的高效降解

为了有效地清除吲哚这一对人体具有严重危害的环境污染物,本研究以栓菌Trametes sp.LS-10C半固态发酵所产的漆酶为催化剂对吲哚进行降解反应。研究考察了介体的种类和浓度、酶加入量、降解体系的pH值、降解温度等因素对降解吲哚的影响。实验结果表明:在以浓度为3.2 mmol/L的丁香醛为介体、漆酶用量为0.12 U/mL、降解体系的pH值为4.5、降解温度为35℃的条件下,该菌所产漆酶对不同浓度吲哚(2.56 mmol/L、3.2 mmol/L和3.84 mmol/L)的降解率分别达到100%、90.2%和77.6%;对漆酶/丁香醛降解吲哚的动力学研究表明其最大反应速率V_(max)为0.22 mmol/(L·min),米氏常数K_(m)值为9.26 mmol/L。

培养条件及表面活性剂的添加对纳豆芽孢杆菌生物膜形成的影响

采用改良的微孔板法培养纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto),通过结晶紫染色定量分析产生的生物膜。结果表明:培养条件为pH 7、温度37℃、培养72 h且在5 g/100 mL葡萄糖-5 g/100 mL NaCl条件下成膜能力最佳。柠檬酸二铵和聚乙二醇-200(polyethylene glycol-200,PEG-200)随着质量浓度的增加对生物膜的形成量呈现先下降后上升的趋势,十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)抑制生物膜的形成,十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)促进生物膜的形成。所以低温抑制生物膜的形成,一定浓度的NaCl和葡萄糖促进生物膜形成,不同的表面活性剂对其生物膜的影响机制不同,为纳豆芽孢杆菌生物膜的研究提供理论基础。

地衣芽孢杆菌抗菌肽萃取条件的研究

通过对萃取剂选取、有机相体积比和反应温度的研究,对地衣芽孢杆菌发酵液中抗菌肽的萃取和反萃取条件进行了优化.结果显示,以正丁醇为萃取剂,V有机相/V水相为1∶2,操作温度为45℃时,单次萃取效率可达44.51%;设定V有机相/V水相为1∶1,操作温度为45℃时单次操作反萃取率为53.80%,二次操作反萃取率达61.28%.利用高效液相色谱对萃取液与反萃取液中的蛋白丰度进行检测,发现原发酵液中大部分的蛋白组分已被除去,从而达到了预处理的效果,有利于后续的分离工作.

三相法制备木瓜蛋白酶的过程研究

为了高效制备木瓜蛋白酶,利用三相分离法对番木瓜乳粉进行分离纯化。对影响分离纯化的主要因素有机溶剂种类及浓度、硫酸铵质量分数、三相成相时间及pH等进行了研究。实验结果表明,该酶的最佳分离条件为:粗酶液与叔丁醇的体积比为1∶1.5,硫酸铵质量分数为50%,成相时间为60 min,体系pH为7.0。在此条件下使用三相法分离出的木瓜蛋白酶纯化倍数为2.98倍,酶活回收率为76%。

副溶血性弧菌生物膜形成及表面活性剂的影响

研究了副溶血性弧菌在不同温度、pH值及NaCl浓度下的生物膜形成规律,采用微孔板法通过结晶紫染色测定生物膜形成量,苯酚硫酸法测定生物膜的胞外多糖,分析了不同的表面活性剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)、柠檬酸二铵对其生物膜形成的影响。结果表明,副溶血性弧菌在1%NaCl-pH 6、1%NaCl-pH 7、3%NaCl-pH 9、5%NaCl-pH 8条件下都能够形成生物膜,且3%NaCl和pH 9为强粘附,成膜最佳。37℃条件下,菌株成膜性最好,低温则有助于抑制生物膜的形成。SDS和PVP对生物膜的影响呈先促进后抑制的趋势,而柠檬酸二铵可促进生物膜的形成。同时,还分析了SDS促进菌膜形成的作用方式,明确600 mg/L的SDS对菌株胞外多糖分泌起促进作用,为病原微生物的防控提供了一定的理论基础。

蚓激酶基因在毕赤酵母中的表达及其发酵条件优化

从赤子爱胜蚓体内克隆得到蚓激酶基因lks2,并成功在毕赤酵母GS115中表达,酶活为254. 4 U/mL。经摇瓶培养条件优化,确定最佳诱导条件为:初始OD_(600)=1. 5,pH 5. 5、温度28℃,此条件下诱导84 h,重组菌GS115-pPIC9K-lks2蚓激酶活峰值为397. 6 U/mL。利用10 L发酵罐进行放大培养,经优化确定最佳菌体接种浓度为9±0. 5 g/L,此条件下高密度发酵使前期培养时间缩短了11. 5 h,蚓激酶活力达到1 098. 2 U/mL,具有十分可观的工业应用潜力。

利用生物传感分析仪快速测定葡萄糖氧化酶的酶活

建立了采用生物传感分析仪快速测定葡萄糖氧化酶酶活的新方法.通过外加过氧化氢酶去除酶反应液中的过氧化氢,排除了其对测定的干扰;酶活测定的最佳条件:取质量浓度为15mg/mL的葡萄糖氧化酶稀释液0.5mL加入5mL质量浓度为3mg/mL的葡萄糖溶液中,在36℃的水浴中反应10min,然后加入过氧化氢酶去除H_2O_2.在此条件下同一批样品测定8次,其RSD为1.14%,与液相色谱法测定的结果相比较,相对误差为1.65%,较其他几种方法更为快捷、精确.

三相法从苦杏仁中分离制备β-葡萄糖苷酶

为了提高苦杏仁β-葡萄糖苷酶的纯化度和酶活回收率,采用三相法从苦杏仁粗酶提取液中制备β-葡萄糖苷酶。分别研究了有机溶剂种类及浓度、硫酸铵饱和度、p H和温度对三相分离过程的影响。结果表明:叔丁醇为最佳有机溶剂,粗提物与叔丁醇的体积比为1.0∶1.5,硫酸铵饱和度为50%,体系p H=5.0,最佳温度为25℃。在该优化条件下,苦杏仁β-葡萄糖苷酶的纯化倍数达到5.97,酶活回收率为85.7%。

氧化葡萄糖酸杆菌的固定化及在鼓泡式反应器中制备乙醇酸

考察了包埋法固定氧化葡萄糖酸杆菌的过程,并且研究了利用该固定化细胞在鼓泡塔生物反应器中转化乙二醇制备乙醇酸。固定化的最优条件为:聚乙烯醇的最佳质量分数为8%,海藻酸钠为0.8%,最适湿细胞包埋量为每毫升凝胶0.27 g。固定化细胞对酸碱的抗性和热稳定性均较游离细胞有所提高。利用固定化细胞在鼓泡式反应器中转化乙二醇制备乙醇酸,在乙二醇质量浓度70 g/L的条件下,首批转化率达到92.6%,并且可以实现连续转化6个批次,平均转化率在85%以上。

氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞转化乙二醇制备乙醇酸

考察了利用氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞转化乙二醇制备乙醇酸的工艺过程。在分批转化的条件下,100 g/L的乙二醇溶液经过30 h左右的反应,生成118.5 g/L的乙醇酸,转化率达到97%以上,静息细胞可以连续使用3个批次,平均转化率达到93.3%。通过补料分批转化,可以进一步的提高产量,经过38 h的反应得到182.5 g/L的乙醇酸,大大提高了转化液中的产物浓度。

酶法原位分离技术制备葡萄糖酸

研究了使用聚乙烯醇-海藻酸钠固定化的葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶作为催化剂,在鼓泡式反应器中采用原位分离技术转化葡萄糖制备葡萄糖酸的过程。研究发现,该转化过程受到产物的抑制作用,通过对树脂的筛选,采用对葡萄糖酸具有较好吸附效果的D335树脂,可以解除产物的抑制作用。结合流加补料的转化方式,葡萄糖酸的转化率可以达到95.5%。连续使用4个批次,其平均转化率在85.7%以上,系统的稳定性较好。

交联柚苷酶聚集体水解柚皮苷制备普鲁宁

为了提高普鲁宁的收率、简化分离提纯的工艺、得到较高纯度的普鲁宁,本实验采用交联柚苷酶聚集体水解柚皮苷制备普鲁宁,以普鲁宁浓度为优化指标,研究了底物浓度、p H、温度、加酶量、反应时间对制备普鲁宁的影响。利用正交设计对水解过程进行优化,确定最佳工艺条件为：柚皮苷浓度13.79 mmol/L、p H=8.0、温度65℃、加酶量18.0 mg/m L、反应时间12.0 h,优化后制备得到的普鲁宁浓度为13.36 mmol/L、收率达到96.87%。连续使用3个批次后,普鲁宁的收率可以达到91.29%,交联酶聚集体的稳定性较好。采用聚酰胺树脂对水解产物进行吸附,体积分数为40%~60%的异丙醇线性梯度洗脱,从0.36 g柚皮苷反应液中可以分离得到0.22 g普鲁宁。

米根霉α-淀粉酶高麦芽糖生成能力相关氨基酸的初步分析

利用计算机辅助模拟分析技术对米根霉α-淀粉酶与麦芽三糖进行分子对接,并选择可能与该酶的高麦芽糖生成能力相关的氨基酸残基进行突变和分析。研究表明:突变体YHR和H286L最适作用温度分别比原酶的最适作用温度(50℃)提高了10℃和5℃;突变体H286L的最适作用pH下降了0.5。与原酶相比,突变体YHR和H286L作用麦芽三糖终产物中麦芽糖含量分别提高了18.87%和16.87%,作用可溶性淀粉终产物中麦芽糖含量分别提高了11.67%和10.32%。初步确定H286与该酶高麦芽糖生成能力之间的关系最为密切,其次为Y80和R333。

交联柚苷酶聚集体水解柚皮苷制备柚皮素

为了提高柚皮素的产率,简化分离提纯的工艺,得到较高纯度的柚皮素,采用交联柚苷酶聚集体水解柚皮苷制备柚皮素,以生成的柚皮素质量浓度和得率为优化指标.研究了底物质量浓度、温度、pH、加酶量、反应时间对制备柚皮素的影响,利用正交设计对水解过程进行优化,确定最佳工艺条件为底物质量浓度4.0g/L、温度55℃、pH 3.0、加酶量18.0mg/mL、反应时间24h.优化后制备得到的柚皮素质量浓度为1.833g/L,柚皮素得率为97.72%,为制备柚皮素提供了一种新的方法.

黏质沙雷氏菌磷脂酶A_(1)辅助蛋白PlaS对宿主菌细胞膜的影响及亚细胞定位

为证明黏质沙雷氏菌磷脂酶A_(1)辅助蛋白PlaS在大肠杆菌BL21(DE3)异源表达中对细胞膜有明显的破坏作用,探究了细胞膜特性的变化,并采用气相色谱-质谱联用技术鉴定了其对细胞膜脂肪酸的影响,通过激光共聚焦显微镜验证了亚细胞水平定位。结果显示:PlaS异源表达后,宿主菌内外膜通透性明显提高、细胞膜流动性与表面疏水性严重下降,表明细胞膜功能已经丧失;脂肪酸饱和程度下降,即直链饱和脂肪酸和反式单不饱和脂肪酸相对含量降低,以及顺式单不饱和脂肪酸相对含量增加、膜刚性增强、流动性减少,细胞膜组分与结构表现异常导致细胞易死亡。激光共聚焦显微镜显示,在宿主细胞膜上发现明显荧光。综上所述,PlaS属于膜蛋白,在大肠杆菌异源表达中会破坏宿主菌细胞膜的结构与功能,表现生长抑制现象,这将为进一步PlaS抑制机理的研究与其功能开发提供一定支持。