烟曲霉角鲨烯环氧化酶基因的克隆

目的 :克隆烟曲霉角鲨烯环氧化酶基因并探讨其与特比萘芬抗烟曲霉活性的关系。方法 :利用聚乙二醇-甘油法将 0 .5 μg烟曲霉基因组DNA文库转化pyrG 烟曲霉AF2 93.1原生质体 ;在含有特比萘芬的最低培养基上筛选耐特比萘芬的pyrG +转化子 ,然后对介导特比萘芬耐药的烟曲霉基因进行序列分析并进行基因克隆 ;最后将克隆的基因重新转化到烟曲霉中以确认其与特比萘芬敏感性之间的关系。结果 :从 5× 10 4个转化子中得到一个耐特比萘芬的pyrG +转化子 ,该转化子表现出特比萘芬特异性耐药性且与质粒高度相关 ;序列分析发现 ,是烟曲霉角鲨烯环氧化酶基因介导了特异性特比萘芬耐药 ;将该基因克隆后重新转化到烟曲霉中 ,结果敏感的烟曲霉再次获得特异性特比萘芬耐药性。结论 :首次获得烟曲霉角鲨烯环氧化酶基因 ,并发现额外拷贝的该基因可以导致特异性特比萘芬耐药这一新型机制。