干扰素抗病毒蛋白MxA和2',5'-OAS在肝胚瘤细胞株中的差异表达

目的了解α干扰素(interferon-α,IFN-α)诱导的抗病毒蛋白MxA和2',5'-寡腺苷酸合成酶(2',5'-OAS)在人肝胚瘤细胞株HepG2和HBV稳定转染的HepG2.2.15细胞中的表达情况。方法将培养的HepG2和HepG2.2.15细胞用IFN-α刺激6h,分离细胞总RNA,经逆转录、32P标记后与尼龙膜上的探针微矩阵(macroarray法)进行分子杂交;并以此来分析HepG2和HepG2.2.15细胞IFN抗病毒基因表达谱。用免疫印迹分析IFN抗病毒蛋白;如,MxA、2',5'-OAS等在肝胚瘤细胞中的表达。结果分析发现在HepG2和HepG2.2.15细胞仅有部分IFN诱导基因表达,多数IFN诱导基因呈低表达或不表达。比较HepG2和HepG2.2.15细胞,发现两者表达IFN诱导基因有差异,即对IFN应答有差异。研究中发现,MxA蛋白在HepG2.2.15细胞中不表达,而在HepG2细胞中却能正常表达。另一种重要的IFN抗病毒蛋白2',5'-OAS,在HepG2.2.15和HepG2细胞中均能表达;在拉米夫啶处理下,HepG2.2.15细胞甚至比HepG2细胞能更好地表达。结论IFN抗病毒蛋白MxA和2',5'-OAS在人肝胚瘤细胞株HepG2和HBV稳定转染的HepG2.2.15细胞中表现出差异的表达模式;HBV及其抗原成分影响人肝胚瘤细胞株的IFN抗病毒基因表达。

乙型肝炎病毒及其抗原成分对干扰素信号传导途径分子和抗病毒蛋白表达的影响

目的了解HBV及其抗原成分对干扰素（IFN） α Janus激酶-信号传导和转录激活子（JAK-STAT）信号传导途径分子和抗病毒蛋白表达可能存在的影响。方法以人肝胚瘤细胞株HepG2细胞为研究对象，分别经质粒转染（以能够表达完整HBV病毒颗粒或HBsAg、HBcAg的质粒pSM2、pHBS2-S和pHBc-EGFP）、病毒感染（以HepG2．2．15细胞培养上清液感染HepG2细胞，其含有完整HBV病毒颗粒和HBV抗原）以及与HBV抗原直接接触刺激等方式处理不同组HepG2细胞，以Northern blot和RT-PCR等方法分析各处理组HepG2细胞的IFN α应答情况，如检测抗病毒蛋白【如粘病毒抵抗蛋白A（MxA）、2＇-5＇寡腺苷酸合成酶（2＇-5＇OAS）、9-27等】和JAKSTAT信号传导途径分子（如STATl）的表达。对数据进行t检验。结果转染pSM2、pHBS2-S和pHBc-GFP质粒后，HepG2细胞能够表达完整的HBV颗粒或HBV抗原，且随着转染时间的延长，HBV颗粒或抗原表达量逐步增多，转染48、96h的细胞培养上清液中HBsAg的S／CO值为0．81±0．1l和2．35±0．33（t=lO．84，P〈0．05），HBeAg的S／CO值为0．69±0．06和1．79±0．13（t=18．82，P〈0．05）。Northemblot分析提示HepG2细胞能够表达IFNα抗病毒蛋白MxA、2’，5’OAS、9-27等，但质粒转染、病毒感染和HBV抗原直接接触刺激的HepG2细胞，IFNQ抗病毒蛋白MxA、2’，5’OAS、9-27等的表达量明显减低，且随着转染时间的延长而进一步减低；此外，STATl的表达也随着HBV颗粒或HBV抗原的表达而受到抑制。结论在体外细胞模型中，HBV及其抗原成分影响IFNα JAK-STAT信号传导途径分子和抗病毒蛋白的表达；HBV具有拮抗或反作用于IFNα抗病毒活性的机制。

新型低密度cDNA Macroarray的建立及其应用于干扰素抗HBV的研究

目的了解人肝胚瘤细胞株HepG2和稳定转染HBV全基因组细胞株HepG2.2.15的干扰素(IFN)抗病毒基因表达谱。方法选择与IFN抗病毒及其信号转导途径相关的288个IMAGE克隆,经聚合酶链反应(PCR)扩增相应的基因片段,将扩增的DNA片段纯化后点样于阳离子尼龙膜上以制备成人工芯片。HepG2和HepG2.2.15细胞经IFN处理后,分离细胞总RNA,进行逆转录并且同时以32P标记;将标记的cDNA靶基因与尼龙膜上的探针进行分子杂交。经Cyclone扫描系统和OptiQuantTM软件处理,将图像信号转换成数据信息;再经Excel软件分析、处理形成Macroarray数据值。结果Macroarray分析提示,在HepG2和HepG2.2.15细胞仅有部分IFN诱导基因表达,多数IFN诱导基因呈低表达或不表达。通过比较HepG2和HepG2.2.15细胞,发现两者表达IFN诱导基因有差异,即对IFN应答有差异。进一步分析还发现,尽管与HepG2细胞存在差异的IFN应答,HepG2.2.15细胞的IFN信号转导途径(JakSTAT途径)却是开放的、未受损伤的。结论HepG2和HepG2.2.15细胞具有差异的IFN抗病毒基因表达谱。

一种HBV研究的新动物模型-喜马拉雅旱獭β-actin基因的克隆及序列分析

目的 喜马拉雅旱獭对土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus,WHV）高度易感,可作为HBV感染的新动物模型.本研究对喜马拉雅旱獭β肌动蛋白（β-actin）的部分cDNA序列进行了克隆和序列分析,为喜马拉雅旱獭在HBV感染研究中的应用奠定基础.方法 根据Genbank的土拨鼠β-actin cDNA的序列设计特异性引物,提取旱獭脾组织总RNA作为模板,RT-PCR扩增旱獭β-actin cDNA序列;PCR产物纯化后连接至T载体（pMD18-T）,构建重组质粒pMD18-T-mhActin.对重组质粒进行PCR初筛及酶切鉴定,选择阳性克隆测序;对所获得的序列进行同源性和种系进化分析.结果 获得的旱獭β-actin序列为349 bp（nt887～1 235）,其中编码序列为323 bp（nt-887～1209）,编码106个氨基酸,包含形成二硫键的2个丝氨酸位点（氨基酸16和氨基酸105）及与β-actin功能相关的2个ATP结合位点、6个凝溶胶蛋白结合位点和6个profilin结合位点.同源性分析发现上述序列与其它哺乳动物β-actin的同源性均高达88 %以上,与土拨鼠β-actin的同源性最高（99.69 %）,其氨基酸序列的同源性为100 %.种系进化树分析提示喜马拉雅旱獭β-actin与土拨鼠β-actin的亲缘关系最近,其次为其它啮齿类动物.结论 成功克隆了喜马拉雅旱獭β-actin的部分序列.序列分析发现喜马拉雅旱獭β-actin与土拨鼠β-actin的同源性最高.