替比夫定(素比伏)体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究

目的观察替比夫定体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用。方法 HBV 复制子 pHBV1.3质粒转染 Huh7细胞,在转染细胞培养液中加入不同浓度的替比夫定,然后在不同时间段观察替比夫定的抗病毒作用。用 ELISA 检测培养上清中HBsAg、HBeAg 水平,用荧光定量 PCR(FQ-PCR)检测培养上清中 HBVDNA 拷贝数,用 Southern blot 分析转染细胞中 HBV 复制中间体。结果替比夫定减少了培养上清中 HBsAg、HBeAg 的表达及 HBV DNA 拷贝数,抑制了转染细胞中 HBV 复制中间体的形成。替比夫定对 HBV 复制子体外复制的抑制作用依赖于药物浓度及作用时间。结论替比夫定在体外对 HBV 有较强的抑制作用。

新的抗病毒核苷类似物替比夫定体外对乙型肝炎病毒复制子的抑制作用

目的:观察新的抗乙型肝炎病毒(HBV)核苷类似物——替比夫定体外对乙型肝炎病毒复制子的抑制作用。方法:将乙型肝炎病毒复制子pHBV1.3质粒转染Huh7细胞,在转染细胞培养液中加入不同浓度的替比夫定,然后在不同时间段观察替比夫定的抗病毒作用。ELISA检测培养上清中HBsAg、HBeAg的表达,荧光定量PCR(FQ-PCR)定量检测培养上清中HBVDNA拷贝数,Southern blot分析转染细胞中HBV复制中间体。结果:替比夫定减少了培养上清中HBsAg、HBeAg的表达及HBVDNA拷贝数,抑制了转染细胞中HBV复制中间体的形成。替比夫定对HBV复制子体外复制的抑制作用依赖于药物浓度及作用时间。结论:替比夫定在体外对HBV复制有较强的抑制作用。

慢性丙型肝炎患者α干扰素和α干扰素受体1的检测

目的建立检测外周血单个核细胞α干扰素受体1(IFNAR1)及检测诱导表达α干扰素(IFN-α)的方法,评价慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)细胞免疫功能与α干扰素治疗的关系。方法Poly IC体外刺激正常对照组和慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染组患者PBMC,利用病毒保护试验研究干扰素治疗前后患者PBMC表达的干扰素抗病毒生物学活性差异;IFN-α治疗前后,RT-PCR检测慢性丙型肝炎患者不同干扰素应答组患者PBMC IFNAR1表达的变化。结果对照组PBMC分泌的干扰素活性显著高于慢性丙型肝炎患者应答组患者(P<0.001);干扰素应答组患者PBMC分泌的干扰素活性随治疗时间延长而增加,治疗1个月后显著高于无应答组患者PBMC分泌的干扰素活性(P<0.01),后者始终处于低下水平;IFN-α治疗期间干扰素应答组患者PBMC IFNAR1水平从治疗前的高表达而逐渐减少,正常对照和干扰素无应答组患者PBMC IFNAR1的表达始终较低。结论慢性HCV感染患者的细胞免疫功能受损,不能正常表达IFN-α,但应答组患者经干扰素治疗后IFN-α表达能力逐渐恢复;干扰素无应答组患者PBMC IFNAR1表达受到严重抑制;慢性丙型肝炎患者PBMCIFN-α活性检测及IFNAR1检测结果也许可以作为干扰素治疗预后的判断指标。

小鼠TIM-3原核表达载体的建立及多克隆抗体的制备与鉴定

目的:克隆小鼠TIM-3基因,构建原核表达载体,制备相应的多克隆抗体并初步鉴定。方法:以小鼠脾细胞总RNA为模板,用RT-PCR方法,扩增得到TIM-3基因编码区,构建pRSET-B-TIM-3原核表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;然后常规免疫家兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,用Western blot、免疫组化、流式细胞术检测抗体的特异性。结果:成功构建的原核表达载体pRSET-B-TIM-3在大肠杆菌中诱导后可以高效表达TIM-3蛋白;免疫获得的多克隆抗体经过ELISA检测,抗体效价为1∶320 000,经Western blot、免疫组化和流式细胞术等鉴定,抗体的特异性较好。结论:成功克隆出小鼠的TIM-3基因,构建了原核表达载体,制备的兔抗小鼠TIM-3多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。

中国乙型肝炎病毒B、C基因型参照序列的建立

目的建立中国HBVB、C基因型参照序列。方法从GenBank中获得来源于中国不同地区的HBV全基因序列，通过基因分型和序列比对，以相同位置频率最高碱基作为参照碱基建立序列；将这些参照序列与国内外的参照序列进行比较，了解其中的不同点；对不同编码区的氨基酸序列进行比较。对B、C基因型HBV的碱基替代情况进行统计学分析，其中1762、1764、1896位点采用妒检验，1858位点采用Fisher＇s确切概率法检验。结果获得了中国HBV B、C基因型参照序列。Bc与Ba、Bj基因型HBV的全基因序列同源性分别为99．32％、95．52％，S基因序列同源性分别为99．71％、98．68％；Cc与C、Caus基因型的全基因序列同源性分别为98．44％、93．97％，S基因序列同源性分别为99．27％、95．01％。与Bj型相比，Bc和Ba型同源性更高；与Caus型相比，Cc和C型同源性更高。不同编码区的氨基酸序列也有差异；两种基因型在1762、1764、1858位点的碱基分布差异均有统计学意义（P值均〈0．05）。结论建立的HBV B、C基因型参照序列可以作为中国HBV参照序列，为设计引物和分析碱基或（和）氨基酸变异提供参考。