艰难梭菌数字化聚合酶链反应-核糖体分型方法及参考图谱的建立

目的建立艰难梭菌数字化PCR-核糖体分型方法及常见基因型的参考图谱。方法利用荧光毛细管电泳技术代替琼脂糖凝胶电泳检测艰难梭菌PCR-核糖体分型产物，建立数字化PCR-核糖体分型方法；利用40株分属于10种核糖体型（RT）的艰难梭菌参考菌株构建常见基因型的数字化参考图谱。结果荧光毛细管电泳技术准确地检测出40株艰难梭菌参考菌株的PCR-核糖体分型片段，并以数字化的形式呈现，10种核糖体型艰难梭菌的PCR-核糖体分型数字化图谱差异明显。同为RT027的21株菌株间、RT002的3株菌株间和RT015的2株菌株间的数字化分型结果相似性都非常高，而7株RT001菌株则可分为4种亚型，2株RT014分为2种亚型。结论成功建立艰难梭菌数字化PCR-核糖体分型方法，同时构建了艰难梭菌10种核糖体型的数字化PCR-核糖体分型参考数据库。

滚环扩增技术检测耐氟康唑白念珠菌TAC1点突变

目的 利用滚环扩增技术检测耐氟康唑白念珠菌的TAC1点突变,建立一种准确、快速、特异的检测核酸单点突变的方法,同时进一步了解TAC1点突变与耐药的关系.方法 收集33株耐氟康唑白念珠菌（8株来自美国,25株来自澳大利亚）,根据文献报道的与耐药有关的点突变和挂锁探针设计原则设计4个挂锁探针.提取DNA、PCR扩增获得TAC1的三个目的 片段;然后用滚环扩增技术检测耐药株的点突变.将滚环扩增所得结果与测序结果进行比较.结果 33株耐氟康唑白念珠菌中,有5株TAC1出现与耐药相关的点突变,分别为T225A（1株）和A736V（4株）,其中4株菌来自美国.4株氟康唑敏感白念珠菌中TAC1未见与耐药相关的点突变.结论 滚环扩增技术能准确、快速检测核酸单点突变;TAC1点突变与耐药的关系有待进一步研究.

莫西沙星耐药的艰难梭菌多重聚合酶链反应检测和基因分型

目的：建立一种多重 PCR 方法用于莫西沙星耐药的艰难梭菌鉴定和初步基因分型。方法根据艰难梭菌 slpA 可变区间核苷酸序列的差异设计5种 slpA 基因型（gr、hr、fr、gc08和078）的特异性 PCR 引物，同时加入检测艰难梭菌管家基因磷酸甘油醛异构酶基因 tpi 的种特异性引物，构建多重PCR 方法；利用9种肠道常见的正常或致病菌验证多重 PCR 方法的特异性，利用46株分属于11个slpA 基因型的艰难梭菌参考菌株来验证方法的检测和分型能力；利用建立的多重 PCR 方法检测39株莫西沙星耐药的临床菌株，以 slpA 测序分型法为参照方法，评估该方法的临床实用性。结果多重PCR 检测9种肠道常见的正常或致病菌 tpi 和5种 slpA 基因型均为阴性；46株艰难梭菌参考菌株 tpi均为阳性，36株分属于5种靶 slpA 基因型（gr、hr、fr、gc08和078）的菌株被正确分型，10株分属于其他6种基因型的参考菌株均无法分型。39株莫西沙星耐药的艰难梭菌临床菌株 tpi 均为阳性，32株检出具体基因型，其中22株为 slpA 基因型 gc08，6株为 hr，2株为 fr，2株为078，与 slpA 测序分型结果一致；7株多重 PCR 无法分型，slpA 测序分型结果显示其基因型均不包含在多重 PCR 分型范围内。结论成功建立一种简单、快捷、临床实验室适用的艰难梭菌检测，且能够分辨出5种 slpA 基因型的多重PCR 方法；莫西沙星耐药的艰难梭菌主要为 slpA 基因型 gc08。