卒中大鼠脑组织抑制性差减文库的构建

目的 :建立抑制性差减文库为获得差异表达基因提供方法。方法 :提取正常组及卒中发作组大鼠全脑组织总RNA ,分离出mRNA。两组mRNA反转录合成cDMA。实验组称为tester,对照组称为driver。限制性内切酶RsaI消化产生平端。将testercDNA分成两份 ,分别连接不同的接头 (Adaptor) ,drivercDNA不连接接头。testercDNA连接好接头以后 ,再和driver进行两轮杂交。第一次PCR时仅有连接不同接头的双链cDNA分子可以呈指数扩增。然后采用巢式引物进行第二次PCR ,进一步减少PCR产物的背景 ,强化差异表达序列。结果 :总RMA经甲醛变性凝胶电泳紫外光下可见 2 8S、1 8S 条带清晰 ,2 8S:1 8S 比值约为 1 5 :1 ,未见降解。双链cDMA经RsaI消化 ,cDNA片段变小。已经扣除的cDMA ,GAPDH晚 5个～ 1 5个循环出现条带 ,说明差减文库得到了有效扣除。结论 :建立大鼠卒中发作及正常大鼠脑组织两个抑制性差减文库 。