罗汉松及响叶杨内生放线菌的分离、活性及多样性研究

目的积累微生物资源,研究内生放线菌的微生态特征及其次生代谢产物的生物活性。方法依据Coombs等的分离方法并加以改进,从采集自成都的罗汉松及响叶杨枝条中分离内生放线菌,对分离菌株做16S rRNA基因部分序列扩增并测序,对其次生代谢产物采用滤纸片法测抗菌活性,以SRB法测其对HepG2细胞株的细胞毒活性。结果分离得到13株内生放线菌,其中10株菌具有不同程度的抗肿瘤活性,占全部菌株的77%,菌株A243具有极强的广谱抗细菌活性和细胞毒活性。A245属于马杜拉菌属,A251属于珊瑚状放线菌属,A246属于诺卡氏菌属,A248、A252属于小四孢菌属,其余8株属于链霉菌属。结论链霉菌是这两种木本植物枝条中的优势内生放线菌,从这两种植物枝条中分离的内生放线菌产生多种活性的代谢产物,可以进一步的研究与开发。

黄芪注射液拮抗阿霉素心脏毒性作用的研究

目的 :研究黄芪注射液对阿霉素心脏毒性的保护作用及其机制。方法 :采用阿霉素体外损伤大鼠心肌线粒体和体内小鼠心脏毒性两种模型 ,应用生化方法测定黄芪注射液对其心脏毒性的保护作用。结果 :阿霉素体外引起大鼠心肌线粒体丙二醛 (MDA)水平升高、谷胱甘肽 (GSH)含量降低及线粒体肿胀等 ,黄芪注射液对上述损伤有明显的保护作用。体内实验表明 ,黄芪注射液对阿霉素引起的小鼠心肌线粒体丙二醛 (MDA)、血清肌酸磷酸激酶 (CK)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性水平增高及超氧化物歧化酶 (SOD)活性降低等损伤均有较好的保护作用。结论 :黄芪注射液能拮抗阿霉素引起的心脏毒性 ,为临床应用黄芪注射液作为抗肿瘤辅助药物提供了实验依据。

基于专利导航的我国中药姜黄产业链SWOT分析

目的:从专利的角度识别并分析我国中药姜黄产业链的优势、劣势、机遇与威胁。方法:采用专利导航结合SWOT分析方法,利用Patsnap全球专利数据库,对比分析中药姜黄领域的中国、美国及PCT国际专利。结果:优势:我国中药姜黄产业进入技术发展期;高校院所技术创新活跃;在姜黄药物组合物、姜黄药物新制剂等领域具备技术优势。劣势:产业专利技术分散;专利质量偏低;现有产品缺乏专利保护。机遇:姜黄在全球获得广泛的应用与认可,在国内获良好的中药产业发展政策支持。威胁:海外市场被国外竞争对手占据,跨国企业在华展开专利布局。结论:建议以全球市场需求与国内政策支持为契机,充分发挥我国中药姜黄产业内部优势,提高产业的国际竞争力。

高效毛细管电泳分析法检测中药红曲的桔霉素含量

目的：建立高效毛细管电泳法测定中药红曲中微量毒性成分桔霉素的方法。方法：采用复合提取剂提取红曲样品，熔融石英毛细管柱50μm×45cm（有效长度40cm）；缓冲体系为20mmol·L^-1硼砂含10mmol·L^-1脱氧胆酸钠（pH9．3），进样压力34．5kPa，分离电压15kV（恒压方式），柱温25℃，检测波长212nm。结果：桔霉素检测的回归方程为Y=9434＋16781X（r=0．990）；最低检测限为0．5mg·mL^-1，相对回收率98．8％～101．1％，日内和日间RSD分别为0．83％～1．54％和1．86～5．09％。结论：本法灵敏准确，简便易行，重现性好，专属性强，可用于中药红曲桔霉素含量的检测。

乙肝病毒前S/S抗原的重组表达质粒对HBV转基因小鼠的免疫治疗效应

目的:观察重组表达质粒pcDNA3.1-S2S和pcDNA3.1-S1S2S对HBVDNA复制和抗原表达的抑制效果.方法:以能表达乙肝表面抗原主蛋白S(HBsAg)的重组真核表达质粒为骨架,构建了分别含有HBV前S1抗原和/或前S2抗原编码基因的pcDNA3.1-S1S2S,pcDNA3.1-S2S,并各以100μg肌肉接种C57BL/6HBVDNA转基因小鼠,2,4wk后各加强免疫1次.然后动态检测小鼠血清HBVDNA水平的变化、抗-HBs和前S2抗体的诱生,以及肝组织内HBsAg、前S2抗原的消长情况.结果:小鼠肝组织内HBsAg,前S2抗原呈逐渐减弱的趋势,8wk后各有1/3的小鼠已不能检出.pcDNA3.1-S1S2S组接种后4,8,12wk抗-HBs阳转率分别为50%、67%、100%,明显高于pcDNA3.1-S2S组(17%、33%、50%)(P<0.05);而前S2抗体阳转率均低于17%.接种后8wk,12wk,pcDNA3.1-S1S2S组和pcDNA3.1-S2S组小鼠血清HBVDNA水平明显下降,均低于自身接种前、接种后4wk以及同期对照组(P<0.05).结论:重组表达质粒pcDNA3.1-S2S和pcDNA3.1-S1S2S接种,能够抑制转基因小鼠体内的HBV复制,而重组质粒中S1基因的共表达使抑制作用得到增强.

RP-HPLC测定红曲中的桔霉素

目的采用HRP-HPLC测定中药红曲中的微量毒性成分桔霉素。方法用复合提取剂提取红曲样品,采用Irrogulour-C18柱(250 mm×4.6 mm,10μm);流动相为乙腈-水(15:85,pH2.8);流速1 ml.min-1;柱温25℃;荧光检测,波长λex=331 nm、λem=500 nm。结果桔霉素7~220 ng与峰面积的线性关系良好(r=0.9999),最低检测限0.5 ng,相对回收率99.8%~103.2%,日内和日间RSD分别为1.76%~3.31%、3.96%~5.02%。16批红曲发酵物中的桔霉素平均含量为21.4±19.1μg.kg-1。结论所用方法灵敏准确、简便、重复性好、专属性强,可用于中药红曲中桔霉素的检测。

融合表达HBsAg/HBcAg的重组质粒诱导的小鼠免疫应答

目的:探讨融合表达HBsAg/HBcAg的重组质粒的免疫诱生效果方法:从乙肝患者的血清中提取HBVDNA,采用PCR技术扩增HBV的S和C基因并拼接成SC片段.构建融合表达质粒pcDNA3.1-SC,以100μg肌肉接种BALB/c小鼠,2,4wk后各加强1次.采用ELISA法检测小鼠血清抗-HBs和抗-HBc,LDH释放法检测体外CTL活性.结果:接种后3,5,8,12wk,小鼠血清抗-HBs阳性率分别达到50%,75%,100%和50%,抗-HBs滴度在第8wk达到峰值.而抗-HBc阳转率低于25%,抗体最高滴度低于1:5.小鼠接种后5wk时的特异性CTL活性为46.9±1.8%(效/靶比100:1).结论:融合表达质粒pcDNA3.1-SC能够同时诱生针对HBsAg/HBcAg的特异性细胞免疫和体液免疫应答,提示研制乙肝的免疫预防和治疗性基因疫苗的可能性.

欧盟药品市场准入审批程序之述评

2002年,欧盟上网公布了传统草药注册程序指令草案,并于2004年正式定稿、颁布、生效.由于该指令和中药准入欧洲市场密切相关,故引起了我国有关中医药管理部门和学术界的关注.由于欧盟在修订有关人用药品法规时,非常重视法规"纵向"发展的连贯性和延续性,因此,一个新法规的颁布常常不是完全取代旧的法规,而是在旧法规的基础上,对其中一些条款内容进行修改和补充.其结果是,新法规只颁布修订的内容,而不是将原法规和修订部分系统地整理出版一套完整的新法规.传统草药注册程序指令就是这样一个典型例证.该指令似乎是一个"支离破碎"的文件,它不能就有关植物药申报技术要求给人们一个完整的知识,而是使人读起来如坠十里雾中,需要不断地"追根溯源"查阅旧的法规内容.据此,在研究和运用欧盟传统草药注册程序指令时,有必要对以往的法规内容以及新、旧法规之间的相互关系有所了解.

GOD-POD法微量化测定方法的建立及其在3T3-L1脂肪细胞和HepG2细胞糖摄取中的应用

目的 建立简单、快捷、费用低廉的糖检测方法 ,用微量化显色反应检测糖代谢。方法 将临床用糖检测试剂盒配套用校准液作为样本 ,缩小反应体积测定在不同葡萄糖含量 ,相同反应体积 ,或相同葡萄糖含量 ,不同反应体积时 ,OD值与葡萄糖的含量关系 ,并用此法测定在胰岛素作用下 3T3 L1脂肪细胞和HepG2细胞的糖代谢。 结果 反应体积缩小后 ,OD值仍与葡萄糖的含量成正比 ,且体积对OD值影响甚微 ,并能反映胰岛素促靶细胞 3T3 L1脂肪细胞和HepG2细胞对糖的摄取利用特性。 结论 GOD POD微量化测试法的建立是成功的 ,且简单、快捷、费用低廉。此法不仅能用于体外培养细胞的糖代谢检测 ,也能用于与糖代谢有关的药物筛选 。

双重表达乙肝病毒前S_2抗原的重组质粒的疫苗效应

目的:乙肝病毒(HBV)的前S2抗原具有比S抗原更强的免疫原性,可以更有效地诱生特异性免疫应答。文中构建含有前S2抗原编码基因的3种重组质粒,观察接种后诱生特异性体液免疫应答的情况。方法:采用PCR技术扩增HBV的S2-S和S1-S2-S基因;同时串联拼接产生S2-S-S2片段。继而构建重组表达质粒pcDNA3.1/S2S、pcDNA3.1/S1S2S和pcDNA3.1/S2SS2。后者意在表达S抗原的同时,双重表达前S2抗原。然后将上述3种质粒分别以100μg肌肉接种BALB/c小鼠,于2、4周后各加强1次。初次接种后3、5、8和12周,分别采血检测小鼠的前S2抗体和抗-HBs。结果:初次接种后3周,S2SS2组小鼠血清的前S2抗体检出率为12.5%,低于S1S2S组(25%)和S2S组(37.5%);但5周时则达到87.5%,并持续到12周,优于S1S2S组和S2S组;并且S2SS2组的前S2抗体滴度达到1∶2000,高于S2S组(1∶500)和S1S2S组(1∶50)。不过,S2SS2组同期的抗-HBs检出率和抗-HBs滴度则低于S1S2S组和S2S组。结论:重组质粒pcDNA3.1/S2S-S2以串联拼接方式双重表达前S2抗原,能够诱生较高水平的特异性前S2抗体,但其诱生抗HBs的能力却明显降低,这是在设计改造基因疫苗时需要考虑的一个重要问题。

HPLC测定骨松宝颗粒中淫羊藿苷的含量

目的测定骨松宝颗粒中淫羊藿苷的含量.方法采用高效液相色谱法,色谱柱为C18柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为乙腈-水(26∶74),检测波长270 nm.结果淫羊藿苷的线性范围为0.0331～0.3310 mg·ml-1, 回归方程为:Y=1.857×103X+11.18 (r=0.9999).结论所用方法简便、快速、准确、专属性好.

采用MDA-MB-231细胞膜进行表皮生长因子受体活性的检测

目的 探讨能否直接利用肿瘤细胞膜进行表皮生长因子受体 (Epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)催化活性检测。方法 首先筛选出EGFR基因表达水平相对较高的细胞株MDA MB 2 31,通过差速离心制备细胞膜 ,采用Westernblotting检测EGFR催化磷酸化的程度。结果 底物被磷酸化 ,加入特异性拮抗剂AG14 78后 ,磷酸化被抑制。结论 利用肿瘤细胞膜检测EGFR活性的设想是成立的 ,并且其方法简便、经济。

PPARγ配体结合域的表达、纯化和鉴定

提取MCF 7乳腺癌细胞的总RNA ,通过RT PCR技术扩增出hPPARγ/LBDcDNA ,并克隆于载体pGEX 1γT上 ,测序表明该序列与已报道序列相同 ,将其转入BL2 1(DE3)大肠杆菌中 ,IPTG诱导表达GST hPPARγ/LBD ,在不同培养温度或IPTG诱导浓度下 ,GST hPPARγ/LBD以可溶或包涵体形式存在 ,表达产物经谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化 ,可被抗hPPARγ多克隆抗体特异识别 。

重组人TRAIL蛋白的原核表达、纯化及鉴定

将含有人TRAIL蛋白表达质粒的大肠杆菌以IPTG诱导表达 ,表达蛋白主要以包涵体形式存在 .经菌体破碎、包涵体分离、抽提及复性 ,用Ni NTASuperflow柱层析及进一步的离子交换色谱分离纯化获得纯蛋白 .SDS PAGE显示纯化的蛋白为 19kD的单一条带 .Westernblot鉴定表明 ,纯化的表达产物与抗人TRAIL蛋白的抗体发生特异性免疫反应 .抗肿瘤生物活性测定表明该纯化蛋白对肿瘤细胞的体外生长具有显著的抑制作用 .

运用荧光素酶报告基因建立PPARγ1的转录激活系统

核转录因子PPARγ与多种重大的疾病有密切关系 ,是近年来基础研究的热点及重要药物筛选靶点 .作者将一个表达PPARγ1全蛋白的重组质粒转染人Jarket细胞 ,通过RT PCR确定其表达后 ,与另一个含有PPRE元件和荧光素酶报告基因的质粒 pTK PPRE瞬时共转染细胞 ,检测到较高水平表达的荧光素酶 .将共转染的细胞以PPARγ的强激活物 15d PGJ2刺激后 ,荧光素酶的表达水平大幅度上升 .实验结果表明 ,已成功地建立了PPARγ转录激活系统 .这对于PPARγ激活剂的研究开发及相关基础研究具有重要作用 .

一种检测环氧合酶的新方法——半定量RT-PCR法

作者研究的目的是建立一种较为灵敏、简便的方法检测环氧合酶COX 2 .先设计了一对针对COX 2的特异性引物 ,建立了以半定量逆转录 聚合酶链反应 (Semi QuantitativeReverseTranscrip tionPCR ,SQRT PCR)方法检测COX 2的mRNA ,用该方法检测 7种结肠癌细胞和非甾体类抗炎药吲哚美辛 ,作用于其中一种细胞后的COX 2mRNA .实验结果显示 ,半定量RT PCR法可以灵敏、快速地反映COX 2mRNA表达水平的变化 ,为寻找新的COX 2选择性抑制剂和分析NSAIDs抗炎作用机理提供了一种新的方法 .