大熊猫国家公园广元片区野生动物及其环境源大肠杆菌流行病学及耐药性调查

为了解大熊猫国家公园广元片区野生动物及其生活环境中大肠杆菌流行病学特点,防止大肠杆菌在该区域造成流行性疫病,探明该区域野生动物对抗生素的耐药情况,本研究2022年8—9月采集大熊猫国家公园广元片区内野生动物粪便、水及土壤样品共计243份,采用16S rRNA、K-B法、高通量荧光定量PCR法和PCR技术对该区域的大肠杆菌进行分离鉴定、药敏实验、耐药基因和毒力基因检测。结果显示:243份样品中共分离鉴定出86株大肠杆菌,分离率为35.39%;该区域内分离到的大肠杆菌对阿莫西林有较高的耐药率(52.33%),对链霉素、庆大霉素等抗生素的耐药率较低(1.16%~9.30%),对头孢他啶、氯霉素、氟苯尼考、甲氧苄氨嘧啶均敏感;携带大量的耐药基因,其中多重耐药类(83.14%)、磺胺类(55.52%)、四环素类(48.52%)抗生素耐药基因携带率较高,其余耐药基因携带率为26.16%~35.72%;分离株携带1~6个毒力基因,irp2检出率(91.86%)最高,其次为ompA、ibeB和tsh(检出率分别为55.81%、69.77%和52.33%),FyuA、fimH和PapA检出率较低(分别为17.44%、19.77%和1.16%);86株大肠杆菌中均未检出5种致泻性大肠杆菌。本研究为大熊猫国家公园广元片区野生动物及环境源大肠杆菌的流行情况提供了科学数据参考,为人兽共患病的防控提供生态学依据。

一株大熊猫源唾液联合乳杆菌对DSS诱导小鼠结肠炎的预防作用研究

目的为了评估唾液联合乳杆菌Ligilactobacillus salivarius 103对小鼠结肠炎发生的预防作用。方法将27只小鼠随机均分为对空白对照组、葡聚糖硫酸钠(DSS)模型组和唾液联合乳杆菌处理组,每笼3只,采用菌悬液灌胃14 d、自由饮用DSS溶液7 d的方法诱导小鼠结肠炎。结果唾液联合乳杆菌处理组小鼠症状轻微,结肠缩短程度与病理组织结构变化不明显,炎症因子(IL-6、TNF-α、MPO)的水平也明显低于DSS模型组。结论唾液联合乳杆菌103能够保护结肠,降低小鼠肠道IL-6、TNF-α、MPO的浓度,缓解炎症症状,有效预防小鼠结肠炎的发生,为其在饲料添加剂、微生态制剂等方面的应用提供了有力支持。

大熊猫脐带间充质干细胞外泌体的分离鉴定及miRNAs富集分析

大熊猫脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)通过旁分泌所释放的外泌体在大熊猫保健与疾病治疗方面具有一定的应用前景。本研究旨在建立大熊猫UC-MSCs外泌体分离方法,开展生物学特征分析和分子鉴定,并研究UC-MSCs外泌体中miRNAs的种类与功能。采用超速离心法从大熊猫UCMSCs培养上清中成功分离外泌体,通过透射电子显微镜进行形态学观察,纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径大小,蛋白免疫印迹法检测特异性分子标记表达。采用Small RNA测序技术对UC-MSCs外泌体中的miRNAs进行鉴定,并对其靶基因进行了预测与功能分析。结果显示,大熊猫UC-MSCs外泌体呈圆形杯托状结构,直径为(79.15±4.81)nm,外泌体标志蛋白CD81与TSG101呈阳性表达而CALNEXIN呈阴性表达。大熊猫UC-MSCs外泌体中的miRNA主要为miR-148-3p(30.28%)与miR-21-5p(21.72%)。本研究首次从大熊猫UC-MSCs培养上清中分离出外泌体,并对其所含的miRNAs进行富集分析及功能预测,为大熊猫UC-MSCs外泌体后续的功能研究及应用奠定基础。

基于双模型融合的大熊猫头部图像分割

在大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的迁地保护和种群饲养管理中,及时、快速地进行个体识别和行为监测,对其健康管理具有至关重要的作用。圈养大熊猫健康状况通常由专门的饲养人员肉眼观测,人力成本高、效率低并且缺乏时效性。基于图像的动物个体识别与行为分析技术效率高、时间成本低,已经成为新的监测发展趋势。已有研究提出,通过大熊猫面部图像的检测和分析,可实现个体识别和行为分类。但该方法依然存在检测精度不足导致识别准确率难以提升的问题。本文提出一种基于YOLOv3和Mask R-CNN的双模型融合方法,实现了大熊猫头部图像分割和精准检测。包含3个部分:YOLOv3完成头部检测,Mask R-CNN完成大熊猫轮廓分割,然后将两个模型的输出进行交并比融合。结果显示,头部检测准确率为82.6%,大熊猫轮廓分割准确率为95.2%,总体头部轮廓分割准确率为87.1%。该方法对大熊猫头部图像的识别率和分割准确率高,为大熊猫的个体识别、性别分类提供了帮助,为行为分析提供了技术参考。

大熊猫源奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速鉴别检测大熊猫3种病原菌的多重PCR方法,本研究根据NCBI登录的奇异变形杆菌(PM)ureR基因、肺炎克雷伯菌(KPN)phoE基因、大肠杆菌(E.coli)phoA基因,设计3对引物,并对各反应条件优化,初步建立检测大熊猫源PM、KPN和E.coli的多重PCR方法。特异性结果显示,本研究建立的多重PCR方法对PM、KPN和E.coli能够分别扩增到308 bp、456 bp和666 bp的目的条带,而对大熊猫常见的其它20种病原菌均无扩增;敏感性试验结果显示,该方法对PM、KPN和E.coli DNA的检测限分别为2.8×10^(7)拷贝/μL(ureR)、3×10^(7)拷贝/μL(phoE)、6×10^(7)拷贝/μL(phoA)。利用本研究建立的多重PCR方法对100份大熊猫临床样品检测,结果显示:PM、KPN和E.coli的检出率分别为30%(30/100)、90%(90/100)和100%(100/100),均与研究报道的单一PCR检出率相同,对PM和KPN的检出率均高于传统病原分离方法(25%、83%)。本研究建立的大熊猫源PM、KPN、E.coli多重PCR检测方法特异性较强、敏感性较高,且可以同时检测3种病原,为大熊猫细菌性疾病的诊断提供了新的检测手段,极大缩短了检测时间,对临床防控相应细菌性疾病具有重要意义。

基于改进YOLOv5s的大熊猫姿态识别

针对大熊猫Ailuropoda melanoleuca姿态识别中,目标存在部分遮挡及背景相似造成识别难度大等问题,本研究对传统YOLOv5s动物姿态识别算法提出3点改进:主干网络引入坐标注意力改进C3模块,使目标定位更加精确;在颈部网络特征融合时,引入BiFPN结构,加强对有效特征的权重比例;在颈部网络特征输出时,采用可变形卷积代替传统卷积,提高对不规则目标的识别。对自制6类姿态数据集进行性能评估后表明,相对传统YOLOv5s模型,改进方法的mAP(0.5)/mAP(0.5∶0.95)达到89.26%/62.09%,提高了3.12%/3.96%,模型参数减少8.6%。本文提出的方法能够提高大熊猫姿态识别精度,为后续行为分析、饲养管理提供技术参考。

牦牛肠道微生物的影响因素研究进展

牦牛是青藏高原代表性的反刍动物,其肠道是重要的消化吸收部位和免疫器官。肠道微生物不仅与宿主消化吸收、生理健康、疾病的发生和发展密切相关,而且对宿主适应不同的地理环境极其重要。近年来,探究各种因素对牦牛肠道微生物组成和功能的影响成为研究热点。本文主要从海拔、饲料、疾病等因素与牦牛肠道微生物结构的关系进行阐述,以期为牦牛的生产管理及肠道微生物研究提供参考。

大熊猫转录因子Klf4在间充质干细胞中的转录调控作用研究

大熊猫Ailuropoda melanoleuca是我国特有的濒危物种之一,对其分子及基因功能的研究可以加深对大熊猫的了解以及提供更加有效的保护。Krüppel样因子4(KLF4)是一个重要的锌指转录因子,在细胞周期调控、细胞生长、迁移、分化、凋亡以及正常组织稳态维持等生理过程中发挥重要作用。此外,KLF4也是体细胞重编程为诱导多能干细胞的重要诱导因子之一。为了深入了解大熊猫Klf4基因的结构和功能,以大熊猫间充质干细胞(MSCs)为材料,通过快速扩增cDNA末端的方法克隆得到转录因子Klf4的cDNA全长序列,分析了其结构特点,并利用RNA-seq技术探索KLF4在大熊猫MSCs中的调控作用。结果表明,大熊猫KLF4在进化过程中比较保守,并在细胞增殖、细胞凋亡、RNA转运和蛋白质生物合成等生物过程中发挥着重要的生理作用。本研究结果将为后续大熊猫的分子水平研究及基因资源保护奠定研究基础。

大熊猫自然保护区(瓦屋山、大相岭)潜在风险区域犬瘟热等病毒病的防控

为掌握瓦屋山和大相岭大熊猫自然保护区潜在风险区域内犬饲养及其携带犬瘟热病毒(CDV)、细小病毒(PV)、轮状病毒(RV)和狂犬病病毒(RABV)的情况,并在潜在风险区域建立犬瘟热等多种病毒病的免疫隔离带,以保护野生大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的种群健康。采用逐户走访、问卷调查、称体重和量体长的方法对保护区潜在风险区域的犬进行数量、饲养方式、体型和性别统计;采用PCR技术和血清中和抗体试验调查犬携带CDV、PV、RV病原情况和RABV在血清中的抗体水平;犬通过接种犬瘟热、腺病毒2型、副流感和细小病毒病四联活疫苗建立保护区犬瘟热等病毒的免疫隔离带。结果显示:瓦屋山和大相岭大熊猫自然保护区潜在风险区域内,共有犬178只,其中51.7%的犬(92/178)为自由散养状态,且以中小型犬(86.0%,153/178)为主;犬携带的RV为大熊猫源RV(GPRV),阳性率为76.9%(60/78);未检测到CDV和PV;12.7%的犬(7/55)RABV血清抗体阳性;犬疫苗免疫率为88.8%(158/178)。研究结果可为大熊猫保护区潜在风险区犬瘟热等多种病毒病的防控预警提供流行病学数据,并为大熊猫自然保护区周边犬的管理提供科学建议。

原核表达的褐黄血蜱唾液腺蛋白和铁蛋白1的免疫保护效果评价

旨在获得褐黄血蜱重组蛋白(rHfFer1和rHfAV422)并评价其作为抗蜱疫苗的免疫保护效果。通过原核表达获得rHfFer1和rHfAV422,然后将22只新西兰兔随机分为3组(皂素对照组和两个免疫组),其中皂素对照组6只,两个免疫组各8只,所有兔均免疫两次,首免14 d后同等剂量进行二免,二免后一周感染幼蜱,根据蜱的饱血率和蜕皮率为指标评估抗蜱效果。结果显示,rHfFer1和rHfAV422免疫组的饱血率和蜕皮率与对照组均存在显著差异(P<0.05),计算得出rHfFer1和rHfAV422的抗蜱效果分别为68.06%和50.00%。研究结果表明,rHfFer1和rHfAV422可以作为抗蜱疫苗研发的候选抗原。

四种致泻性大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及在大熊猫上的应用

致泻性大肠杆菌可引起大熊猫血水样便、休克,严重者可危及生命。为准确鉴定4种致泻性大肠杆菌病原,本研究通过对引物浓度、退火温度、反应条件等进行优化,建立了能同时检测EPEC和EHEC的多重PCR方法以及ETEC和EAEC的多重PCR方法。结果得出:两种多重PCR方法特异性强,仅对特有的毒力基因进行扩增,对其他10种大熊猫源病原菌的扩增结果均为阴性;敏感性较高,细菌基因组DNA检测中EHEC和EPEC的检测下限为2.71×10^(4)拷贝/μL,EAEC的检测下限为3.23×10^(4)拷贝/μL,ETEC的检测下限为3.23×10^(3)拷贝/μL;菌液检测中EPEC和EHEC的检测下限为1.85×10^(4)CFU/mL,ETEC的检测下限为2.9×10^(3)CFU/mL,EAEC的检测下限为2.62×10^(4)CFU/mL;不同时间段重复8次,均扩增出对应的目的条带,证明重复性好。利用多重PCR和单一PCR方法分别检测110份样品,结果得出esc V基因阳性率为1.82%(2/110),其余均为阴性;多重PCR与单一PCR方法的阳性符合率为100%。

大熊猫源产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的耐药性和致病性研究

为了掌握产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(CRKP)在圈养大熊猫中的流行、耐药和致病情况,本研究采用碳青霉烯酶Carba NP检测法从178株大熊猫源肺炎克雷伯菌中分离鉴定出8株CRKP(4.5%)。进一步采用纸片扩散法(K-B法)和PCR技术分别对CRKP分离株进行耐药性和碳青霉烯酶基因型研究,随机选取其中一株CRKP分离株E28研究其对小鼠的致病性。结果显示大熊猫源CRKP对氨曲南、卡那霉素、庆大霉素、氧氟沙星和诺氟沙星敏感,对碳青霉烯类抗生素耐药严重,其中对亚胺培南耐药率(87.5%)高于美罗培南(12.5%);6株CRKP的碳青霉烯酶基因型为blaKPC2-13酶型,2株为bla KPC2-13+bla NDM-1酶型;CRKP分离株E28对小鼠的半数致死量(LD50)为5.6×10^(7)cfu/mL。本研究首次证实CRKP存在于圈养大熊猫中,在大熊猫的临床治疗中应合理使用抗生素,避免CRKP进一步扩散。

大熊猫白血病抑制因子RNAi干扰载体的构建及应用

旨在构建大熊猫白血病抑制因子(LIF)RNAi重组质粒,以期进一步研究LIF对大熊猫骨髓间充质干细胞(PDBM-MSCs)的调控作用.试验设计3组大熊猫LIF shRNA慢病毒pLKO.1 puro-LIF-down干扰载体,通过慢病毒的方式感染PDBM-MSCs,经q-PCR鉴定重组质粒pLKO.1 puro-LIF-down-1抑制效果最显著.pLKO.1 puro-LIF-down-1实验组和空质粒对照组比较发现,LIF mRNA表达水平抑制后能够显著下调细胞周期调控基因CDK2、CCNB2、CCND3的mRNA表达水平(P<0.05);显著上调凋亡基因P53、P16、P27、caspase3的mRNA表达水平(P<0.05);显著下调干性基因KLF4、SOX2的mRNA表达水平(P<0.05).以上结果表明,此次研究成功构建出大熊猫LIF RNAi干扰载体,LIF对PDBM-MSCs的生长和干性维持具有重要的调控作用,为大熊猫干细胞的体外培养及干性机制的研究奠定基础.

大熊猫孕体B超检查的体位探究

为探索减食期大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)孕体B超检查的合适体位,以成都大熊猫繁育研究基地的16只妊娠后期大熊猫为研究对象,在大熊猫减食期开展孕体B超检查。结果显示:9只妊娠后期大熊猫子宫有1或2个孕体;发现孕体的体位有仰躺和非仰躺(趴、侧躺、半蹲和犬坐等);妊娠后期在非仰躺体位下检测到孕体的时间及孕体的体长与仰躺下的结果相近。通过非仰躺体位对妊娠后期大熊猫开展孕体B超检查大幅减少了对母兽行为训练的要求,改变了现有孕体B超检查思路,更尊重妊娠母兽自身意愿,减少了妊娠母兽的应激反应,更有利于孕体B超在大熊猫繁育中的大范围推广。

发情期大熊猫宫颈黏液结晶周期性变化研究

目前，圈养大熊猫的发情、排卵鉴定一般通过雌激素和孕激素水平测定及行为观察，但雌激素水平的测定存在一定的滞后性，同时对于发情行为不典型的雌性个体通过行为观察也无法判断是否达到了发情高潮。宫颈黏液评分法简便易行，已在人及家畜的排卵预测方面得到了广泛应用，但至今尚未见到关于大熊猫在发情周期中宫颈黏液评分及变化的报道。试验对发情期大熊猫宫颈黏液结晶的周期性变化进行了探讨，以期提供另外一种发情及排卵的鉴定手段，指导大熊猫的繁殖生产工作。

大熊猫寄生虫病研究现状

随着对大熊猫繁育和健康养护问题的深入研究,以及寄生虫学的发展,大熊猫的寄生虫虫谱愈见丰富,大熊猫寄生虫病亦愈见复杂,给大熊猫寄生虫病的诊断与防治带来了一定的困难。论文综述了大熊猫寄生虫的种类及其危害、诊断与防治措施等,以期为大熊猫寄生虫病的研究和防控提供参考。

大熊猫肠道乳酸菌分离鉴定及耐药表型和基因型分析

通过培养法从健康大熊猫Aliuropoda melanoleuca新鲜粪便中分离乳酸菌,然后采用药敏纸片法(K-B法)和PCR对其进行耐药分析。共分离到79株乳酸菌,其对卡那霉素(99%)、磺胺异恶唑(99%)、多黏菌素B(90%)、阿米卡星(87%)、氨曲南(84%)、诺氟沙星(84%)、万古霉素(84%)、甲氧苄啶(81%)和环丙沙星(65%)的耐药率较高,对头孢类、青霉素类、四环素类、氯霉素类、大环内脂类、林克霉素类较敏感;其中15株检出耐药基因,1株携带2种耐药基因;共发现4种不同的耐药基因:四环素类tetM(检出率13.9%)和tetW(检出率3.8%)、β-内酰胺类bla TEM(检出率1.3%)、氯霉素类cat(检出率1.3%)。结果表明,大熊猫肠道乳酸菌对目前常用的抗生素敏感,可为大熊猫临床抗生素的合理用药提供科学依据,为大熊猫肠道疾病提供科学指导。

圈养大熊猫个性与应激反应研究进展

随着饲养管理模式的逐步完善,圈养大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的繁殖率、幼崽存活率以及福利水平稳步提升。目前,关于动物个性的研究逐渐在行为生态学领域受到重视,且已有研究结果表明大熊猫个体间存在个性特征差异。在此背景下,梳理了国内外关于圈养大熊猫个性研究、应激反应及相关内容,讨论了个性差异与应激水平的关系,以期为进一步改善圈养大熊猫个体福利状况提供新的方向。

幼年大熊猫石膏样小孢子菌性皮癣病的防治

近年来成都大熊猫繁育研究基地有多只幼年大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)发生以脱毛、脱屑和水肿为主要症状的皮肤癣菌病,通过综合应用临床诊断方法确认病原为石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum),经药敏试验与临床实践筛选出局部外用萘替芬酮康唑等防治措施,最终取得满意效果。本研究对幼年大熊猫石膏样小孢子菌性皮癣病的流行病学、临床特点进行介绍,并对幼年大熊猫石膏样小孢子菌性皮癣病的诊断方法、致病机理以及防治措施进行阐述,可为大熊猫皮肤癣菌病的科学防治提供参考。

大熊猫精子低渗膨胀试验与其他精子质量评估试验相关性研究

利用解冻后的大熊猫冷冻精液,分别进行体外存活试验、顶体反应试验、异种穿卵试验和低渗膨胀试验,并对低渗膨胀试验与其他试验作相关性分析。结果显示:各试验之间存在一定的相关性。精子低渗膨胀率与精子的体外37℃存活时间呈显著正相关,r=0.79(P<0.05);与体外异种受精率呈极显著正相关,r=0.90(P<0.01)。说明大熊猫精子的低渗膨胀试验可以作为精子质量评价的重要指标。