EMA-qPCR检测金黄色葡萄球菌活菌方法的建立

目的利用叠氮溴乙锭(EMA)结合实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)技术,建立快速、定量检测金黄色葡萄球菌活菌的方法。方法菌悬液72℃水浴,每隔1 min取样计数,用不同浓度EMA作前处理后进行qPCR反应,选择最佳处理浓度和曝光时间,样品10倍梯度稀释后做叠氮溴乙锭-实时荧光定量聚合酶链反应(EMA-qPCR),结合平板计数法探索该方法的灵敏度,用表皮葡萄球菌、副溶血性弧菌、福氏志贺菌等验证该方法的特异性,将模拟样品用2种方法检验并比较。结果水浴14 min及以上能完全杀死活菌,EMA处理浓度≥2μg/mL时PCR结果判定为阴性,曝光时间对实验结果影响不大,菌量的对数值与循环阈值(Ct)有较好的线性关系,且y=-3.59x+40.59,R2=0.988。理论上该方法的最低检测浓度约为36.3 CFU/mL,非金黄色葡萄球菌的Ct值均>35或无Ct值,普通qPCR实验结果 Ct值均低于EMA-qPCR实验结果。结论 EMA-qPCR是一种快速、灵敏度较高、特异性强且能分辨死活金黄色葡萄球菌的方法。