特异性溶瘤重组腺病毒KH901对荷瘤鼠肿瘤生长的抑制作用和表达GM-CSF的研究

目的探讨特异性溶瘤重组腺病毒KH901的抗肿瘤效果及表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平。方法裸鼠皮下接种人肝细胞癌(Hep3B)细胞或人前列腺癌(LNcap)细胞,建立相应裸鼠移植瘤模型。KH901瘤体内注射给药,同时设阳性对照〔5-氟尿嘧啶(5-FU)或顺铂尾静脉注射〕和阴性对照〔生理盐水(NS)尾静脉注射〕,以相对肿瘤增殖率(T/C%)和抑瘤率观察抗肿瘤效果;建立人肺癌(A549)裸鼠移植瘤模型,瘤体内注射KH901,分别于首次给药后第2、7、11、14、18、36d各取3只动物眶静脉采血并摘取肿瘤,以ELISA法测定血清和肿瘤匀浆液上清中GM-CSF含量。结果1在Hep3B裸鼠抑瘤实验中,KH901高剂量(3×1010VP/鼠)组的T/C%和抑瘤率分别为7.31%、93.61%,与KH901低剂量(3×108VP/鼠)组(40.27%、68.76%)和5-FU组(37.33%、61.49%)相比显示出较强的抑瘤效果(P<0.05)。2在LNcap裸鼠抑瘤实验中,KH901多次给药(3×1010VP/鼠×3)组的T/C%和抑瘤率分别为5.47%、95.29%,其抑瘤效果强于顺铂组(25.47%、71.93%),但与KH901单次给药(3×1010VP/鼠×1)组(12.94%、87.94%)相比差异无统计学意义。3在A549裸鼠移植瘤模型中,肿瘤和血清中的GM-CSF分别在第7d〔(47.72±9.21)ng/mg〕和第11d〔(92.45±18.64)ng/mL〕出现高峰,随后,GM-CSF表达量逐渐降低。结论KH901有明显的抗肿瘤作用,在体内肿瘤中表达高水平的GM-CSF,并渗入血管到循环系统,形成血液GM-CSF的高峰。

特异性溶瘤重组腺病毒KH901的体外特异性抗肿瘤作用研究

目的研究特异性溶瘤重组腺病毒KH 901在体外培养的人肿瘤细胞中的选择性复制和杀伤作用。方法以感染复数(M O I)=2 PPC的KH 901和野生型腺病毒(A d5)感染人肿瘤和正常细胞,72 h后采用病毒滴定法测定病毒滴度;以M O I=10 PPC和1 PPC的KH 901感染人肿瘤和正常细胞,24 h后通过EL ISA法和TF-1依赖细胞株/M TT比色法测定粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的免疫活性和生物活性;以M O I分别为0、0.1、1、10、100、1000 PPC的KH 901和野生型A d5感染人肿瘤和正常细胞,采用M TT法测定各细胞活力,计算半数药物有效浓度(EC50)。结果野生型A d5在正常细胞和肿瘤细胞中均大量复制,均表现出明显的杀伤作用;KH 901在肿瘤细胞中大量复制〔(2526.4±136.8)^(2796.6±104.6)TC ID50/ce ll〕,表达大量的人GM-CSF〔(1177.793±6.62)^(3924.497±17.79)IU/(106细胞.24 h)〕,并显示出明显的杀伤作用〔EC50为(0.31±0.06)^(0.19±0.01)p fu/ce ll〕,在正常细胞中KH 901复制较差〔(56.8±9.2)^(90.1±14.4)TC ID50/ce ll〕,只有少量的GM-CSF产生〔(13.397±0.82)IU/(106细胞.24 h)〕,杀伤作用轻微〔EC50为(92.33±9.12)^(121.20±19.94)p fu/ce ll〕,两者间差异有统计学意义(P<0.05)。结论KH 901具有肿瘤选择性复制和杀伤作用,并能表达具有生物活性的GM-CSF,显示出治疗实质性肿瘤的潜力。

以血管内皮生长因子及其受体为药靶的抗肿瘤药物的研究进展

以肿瘤血管形成为靶点的抗肿瘤治疗已成为近年来研究的热点。血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)是目前所知作用最强的促血管形成因子。本文就目前阻断VEGF信号传导途径的抗肿瘤药物研究的最新进展与耐药性等问题作一综述。

应用荧光原位杂交技术检测康柏西普基因在CHO细胞染色体上的整合状态

CHO细胞是常用的哺乳动物表达工程细胞。外源基因整合至CHO细胞染色体后,在大规模蛋白质生产过程中,由于相关压力撤除,外源基因存在丢失的可能,因此有必要对其整合稳定性进行检测。康柏西普(conbercept)是一个能够特异性结合VEGF-A的各种异构体、VEGF-B以及PlGF,从而发挥抗血管生成活性的融合蛋白。康柏西普目前已在美国进入Ⅲ期临床试验。本文运用荧光原位杂交对康柏西普基因在CHO细胞的整合状态进行了检测,发现经过4和19次传代后,康柏西普基因依然能稳定整合在基因组上,并且呈现出3个特点:(1)分布在一条染色体上,而不是多条染色体上;(2)分布在较长的染色体上;(3)在同一染色体上有较多拷贝数。同时,荧光定量PCR结果证明基因拷贝数无明显改变,ELISA检测证明蛋白表达水平亦无明显改变。上述实验证明在经过19次传代以后,康柏西普基因仍然稳定整合在基因组中,并可活跃表达,为康柏西普大规模生产及产品质控提供了有力依据。

以VEGF/VEGFR为靶点的抗肿瘤药物的研究进展

肿瘤的生长和迁移依赖于大量新生血管的生成,其中VEGF/VEGFR途径在肿瘤新生血管生成中起关键作用。近年来,以VEGF/VEGFR作为靶标的抗肿瘤药物的研发取得了很大的进展,已有数种药物进入临床试验或已上市。针对VEGF/VEGFR信号传导途径研发的抗肿瘤药物主要包括中和VEGF/VEGFR的抗体(如贝伐单抗、IMC-1121B)、可溶的VEG-FR类蛋白(VEGF-Trap)和酪氨酸激酶抑制剂(索拉非尼,舒尼替尼)等,其中VEGF的人源化抗体贝伐单抗是第一个被美国FDA批准上市的抗血管生成药物。虽然以VEGF/VEGFR为靶点的抗肿瘤药物疗效显著,但也发现其有某些不良反应,如血压升高、胃肠穿孔、血栓形成等。此类药物在与传统的放化疗药物联合使用治疗肿瘤时具有协同增效作用,但这种作用机制还不清楚。综述还对抗血管生成药物抗性的原因进行了讨论。

食品药品中N-亚硝基二甲胺检测方法研究进展

目的总结食品药品中N-亚硝基二甲胺(NDMA)检测方法的研究进展。方法通过梳理食品和药品中NDMA的由来,总结食品和药品现行标准中传统检测方法及新型分析技术。结果NDMA的检测方法包括超临界流体色谱法、离子色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱法、气相色谱-热能分析法、气相色谱-质谱法及其他。结论现行标准中传统检测方法优缺点各异,新方法、新技术用于食品药品中NDMA的定性和定量分析,可为我国食品药品监管部门提供技术支持,切实保障民众的饮食及用药安全。

实验室信息管理系统在药品标准管理中的应用

目的提高药品标准管理水平。方法总结传统药品标准管理的内容与不足,分析实验室信息管理系统(LIMS)在某院药品标准信息化管理中的应用效果与优势,并提出相关建议。结果传统药品标准管理内容主要包括标准的收集、整理、受控编号、勘误、查新、查询与发放、回收作废标准;不足有查询困难且费时,标准受控编号过程烦琐,标准有效性难以判定,无法实施分权限管理。LIMS药品标准管理内容主要包括标准收集、整理,受控编号,纸质单篇标准转为电子标准并导入LIMS中的药品标准库,查询,勘误与修订,查新,作废标准状态标识管理,分权限管理;其优势为提高查询效率,可控溯源,权限分配管理灵活,降低成本。应用LIMS管理药品标准时,建议成册标准无需扫描为.pdf文件,建立相应的电子目录即可查询;纸质标准原件按要求存放于标准管理科,编号采用三编号定位法;完善电子流程,增强电子标准的保密性;加快推进相关法规、制度的发布与实施。结论LIMS在药品标准管理中的应用,可有效解决传统药品标准管理的不足,规范业务流程和管理体制,提高药品标准管理水平。

渗出型老年性黄斑变性治疗药物的研究进展

抗血管内皮生长因子（VEGF）生物制剂ranibizumab（商品名Lucentis）、pegaptanib（商品名Macugen）等的临床应用，改变了渗出型老年性黄斑变性（AMD）等脉络膜新生血管（CNV）疾病药物治疗的格局，但需要长时间反复玻璃体腔注射是其主要缺点。一些新型的VEGF受体融合蛋白、络氨酸激酶抑制剂、RNA干扰分子、调节细胞生长和代谢的sirolimus、整合素（integrin）拮抗剂以及基因治疗均引起了研究者关注，而且有些已经显露出良好的应用前景。随着对眼部新生血管机制研究的进一步深入，有望开发一些针对新生血管整个信号传递多个环节的治疗药物，或通过基因治疗手段在AMD病灶区域长久表达抗血管生成药物，为AMD的药物治疗带来了新的希望。

RP-HPLC-ELSD法测定康柏西普眼用注射液中辅料吐温20的含量

目的： 建立反相高效液相色谱法联用蒸发光散射检测器测定康柏西普眼用注射液中辅料吐温20含量的分析方法。 方法： 采用Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.7 μm，4.6 mm×150 mm）色谱柱，以乙腈-纯水为流动相进行梯度洗脱（0-5 min，5%B；5-6 min，5%B→60%B；6-10 min，60%B→80%B；10-15 min，80%B；15-15.01 min，80%B→5%B；15.01-20 min，5%B），流速0.5 mL·min^-1，蒸发光散射检测器漂移管温度为45 ℃，雾化压力设为2.8×10^5 Pa。 结果： 吐温20进样量在1.12-6.72 μg范围内，与色谱峰面积呈良好线性关系（R^2〉0.999）；高、中、低浓度样品的回收率均在100%±10%范围内。 结论： 本法经方法学验证可用于康柏西普眼用注射液中辅料吐温20含量的检测。

康柏西普制品中CHO细胞DNA残留量的检测

目的建立特异的CHO细胞DNA残留量荧光定量PCR（Q-PCR）检测方法。方法采用DNeasy Tissue Kit提取CHO细胞基因组DNA,制备DNA标准品;确定Q-PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,并验证其专属性、准确性及精密性;用建立的方法对1003b02、1008b05、1012b09、1104b04、1108b13、1112b24批康柏西普原液的CHO细胞DNA残留量进行检测。结果建立的标准曲线Ct值与模板DNA浓度的对数值之间呈良好的线性关系,相关系数为0.99以上;检测HUVEC、HEK293细胞的DNA残留量均无特异性扩增曲线;检测高、中、低浓度的DNA标准品（105、103、101pg/ml）的平均回收率均在Q-PCR方法可接受的回收率范围（50%~200%）内,批间变异系数分别为9.3%、21.8%、26.8%;检测100pg/ml浓度的DNA标准品的平均回收率为111.6%,变异系数为20.4%;康柏西普原液的DNA残留量远低于100 pg/剂量。结论已成功建立特异的CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,该方法专属性好,准确性及精密性高,可作为CHO宿主细胞DNA残留量的常规检测方法。

荧光偏振法测定融合蛋白制剂中聚山梨醇酯20的含量

目的建立测定融合蛋白制剂中聚山梨醇酯20(Tween 20)含量的荧光偏振检测方法,并进行验证。方法利用疏水性荧光染料DAF(5-dodecanoylaminofluorescein)与Tween 20胶束内的非极性核心结合,在485 nm激发波长下产生的荧光偏振强度与溶液中胶束浓度呈正相关,来确定样品中的Tween 20浓度。对建立的方法进行专属性、准确性、精密性、拟合度验证。结果该方法的专属性较好,可排除检测体系中蛋白的干扰;该方法重复检测3次高(250μg/ml)、中(150μg/ml)、低(50μg/ml)、定量下限(lower limit of quantitation,LLOQ,25μg/ml)浓度样品的平均回收率均在(100±20)%的可接受范围内,批内和批间变异系数均小于15%;标准曲线拟合度良好。结论立的荧光偏振法专属性、准确性、精密性良好,可用于蛋白制剂中Tween 20含量的测定,并适用于稳定性考察过程中Tween 20有效浓度的监测。

抗康柏西普抗体筛选用ELISA检测方法的建立

目的:为评价康柏西普免疫原性,建立一种恒河猴血清中的抗康柏西普抗体检测方法。方法:建立一种以康柏西普为包被蛋白、羊抗人Ig G Kappa light chain抗体为检测抗体的ELISA检测方法,并验证其精密度和专属性。同时运用细胞增殖实验确定阳性样品抗康柏西普抗体的活性。结果:所建立的检测方法最佳包被浓度为5μg·m L-1,检测抗体的最佳稀释倍数为2 500倍。阳性判断阈(cut point)为0.162,批内和批间变异系数均未超过15%。康柏西普浓度在小于10μg·m L-1时对检测无干扰。24个血清样品中,抗康柏西普抗体阳性率为62.5%,HUVEC细胞增殖实验显示无阳性血清具有中和康柏西普生物学活性的能力。结论:经验证,该方法可应用于抗康柏西普抗体的检测,为临床前及临床研究提供支持。