治疗性乙型肝炎疫苗临床研究进展

乙型肝炎病毒感染所致的慢性肝炎是严重的全球性公共卫生问题,目前使用的药物仅能抑制病毒复制,不能彻底清除病毒.如何有效、全面地激发患者的免疫系统,重建对乙型肝炎病毒的免疫力,可能是消除慢性感染的关键.治疗性乙型肝炎疫苗有望成为新的治疗策略.目前,国内外研究的治疗性乙型肝炎疫苗主要包括蛋白疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗和自体树突状细胞疫苗,此文对疫苗的临床试验进展及其与抗病毒药物联合应用研究进行综述.

含前S表位重组HBsAg联合重组HBcAg的免疫原性研究

目的 研究含前S表位重组HBsAg（SS1 S2）与重组HBcAg（C）联合免疫BALB/c小鼠的体液和细胞免疫应答.方法 用纯化的SS1S2与C分别配制含或不含Al（OH）3佐剂（Al）的疫苗.采用简单随机法将雌性BALB/c小鼠分为5组：阴性对照（NC）、SS1S2、SS1S2＋C、SS1S2＋ Al、SS1S2＋C＋Al,各组分别于0和21 d进行腹腔免疫,对照组注射磷酸盐缓冲液.初免及加强后1周各取一半小鼠采血,采用ELISA法测定抗-HBs、抗-前S1、抗-前S2和抗-HBc滴度;常规制备脾淋巴细胞,用酶联免疫斑点法测定分泌IFN-γ的T细胞频数.采用t检验对各组结果进行比较.结果 联合HBcAg的疫苗组均产生了较高水平的抗-HBs、抗-前S1、抗-前S2和抗-HBc.初免后1周,SS1S2＋C组的抗-HBs阳转比例（1/5）高于SS1S2组（0/5）、SS1S2 ＋Al＋C组（4/5）高于SS1S2 ＋Al组（3/5）;SS1S2＋C组的抗-前S1阳转比例（3/5）高于SS1S2组（0/5）;HBcAg对抗-前S2的产生无影响.加强免疫后,各疫苗组的抗体滴度均升高,联合HBcAg的疫苗组各抗体滴度明显高于SS1S2疫苗组.各组疫苗免疫后均可诱导细胞免疫应答,初免后SS1S2＋C和SS1S2＋ Al＋C组分泌IFN-γ的T细胞频数显著超过SS1S2和S1S2＋Al组（t值分别为2.926、2.974,P值均＜0.05）;加强免疫后,各组均有加强效应,SS1S2＋C组的T细胞频数明显超过SS1S2组（t=4.604,P=0.010）.结论 SS1S2联合HBcAg可在BALB/c小鼠中诱导较强的免疫应答,HBcAg可增强SS1S2诱导的体液及细胞免疫应答.

乙型肝炎病毒核心抗原在疫苗研究中的应用

乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B virus core antigen，HBcAg）是乙型肝炎病毒的核衣壳蛋白，具有高度的免疫原性，能自我装配形成病毒样颗粒，并可接受外源基因的插入。HBcAg作为载体和佐剂已用于数十种病原微生物抗原表位的表达和新型疫苗的研发。此文就HBcAg的结构特点、免疫原性及其在疫苗研究中的应用进展作一综述。

含PreS1、PreS2和S抗原的重组乙型肝炎疫苗辅以不同佐剂在HBV转基因小鼠中的免疫原性

目的 研究以免疫刺激复合物（immune stimulating complex，ISCOM）或Al（OH）3为佐剂的含PreS1、PreS2和S抗原的重组乙型肝炎疫苗在HBV转基因小鼠中诱导的免疫应答。方法 将纯化的含PreS1、PreS2和S抗原的重组HBsAg（SS1S2）分别辅以ISCOM或Al（OH）3佐剂制成疫苗。HBV转基因小鼠每月肌内注射1针疫苗，共注射7针。免疫前及每针后1个月称量小鼠体重，观察小鼠生长情况。免疫前及每针后1个月采血，用ELISA检测HBV S、PreS1、PreS2抗原及其相应抗体。7针后1个月分离小鼠脾淋巴细胞，用酶联免疫斑点试验分别测定分泌IL-4、IL-5、IFN-γ的效应T细胞频数。结果 小鼠生长状况良好，每针后体重均有增长。首针后1个月，10只ISCOM＋SS1S2免疫鼠分别有3和1只抗S和PreS1抗体阳转，无一小鼠抗PreS2抗体阳转；10只Al（OH）3＋SS1S2免疫鼠的抗体均为阴性。7针后1个月，10只ISCOM＋SS1S2免疫鼠的抗S和PreS1抗体均阳转，8只抗PreS2 抗体阳转；10只Al（OH）3＋SS1S2免疫鼠分别有9、7和1只抗S、PreS1和PreS2 抗体阳转；ISCOM＋SS1S2组和Al（OH）3＋SS1S2组的抗S抗体几何平均滴度分别为1：15 647和1：1 039，差异有统计学意义（t=5.18，P=0.000）。7针后1个月，ISCOM＋SS1S2组和Al（OH）3＋SS1S2组分泌IL-4的斑点细胞数分别为219和78斑点形成细胞（spot-forming cell，SFC）/106细胞（t=10.50，P=0.000），分泌IL-5的斑点细胞数分别为286和34 SFC/106细胞（t=19.53，P=0.000 ），差异有统计学意义。结论 含PreS1、PreS2和S抗原的重组乙型肝炎疫苗辅以ISCOM或Al（OH）3佐剂在HBV转基因小鼠中均具有免疫原性，且ISCOM＋SS1S2的免疫原性强于Al（OH）3＋SS1S2。

新型冠状病毒疫苗的研发进展及分析

随着新型冠状(简称:新冠)病毒疫情在全球愈演愈烈,越来越多的人们将疫情遏制的希望寄托于新冠病毒疫苗的研发。目前全球已经有多个研究团队,采用了不同的疫苗开发技术路线开展新冠病毒疫苗的研发。本文对目前不同路线新冠疫苗的开发与研究现状进行了综述和分析,同时也探讨了这些不同疫苗今后发展的可能性。

小鼠血清乙型肝炎病毒前S2抗体间接ELISA检测方法的建立

目的建立小鼠血清乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)前S2抗体间接ELISA检测方法。方法以HBV前S2(1～26)多肽包被酶标板,利用方阵滴定法确定间接ELISA法的最适工作条件,验证该方法的精密度、灵敏度和特异性,并与商品化试剂盒进行比较。结果确定最佳抗原包被浓度为2μg/ml;血清稀释度为1︰10,37℃反应30 min;HRP标记的羊抗小鼠IgG最佳稀释度为1︰10 000,37℃反应30 min;TMB底物37℃显色15 min,以2.1×阴性对照血清A450均值(阴性对照血清小于0.05时按0.05计算)为Cut-off值。该方法具有良好的试验内和试验间精密度;与商品化试剂盒比较,灵敏度为100%,特异性为97.3%,二者符合率为98.5%。结论已成功建立HBV前S2抗体间接ELISA方法,可用于小鼠血清中前S2抗体的检测。

毕赤酵母表达的含前S抗原重组乙型肝炎疫苗的稳定性

目的考察毕赤酵母表达的含前S抗原重组乙型肝炎疫苗原液和成品的稳定性。方法将3批疫苗原液置4℃存放,分别于0、1、2、3、6个月时取样,测定其在各时间点的乙型肝炎表面抗原S、前S1(PreS1)、前S2(PreS2)抗原滴度及HPLC纯度;将3批疫苗成品置25℃和4℃存放,进行加速稳定性和长期稳定性试验,分别于0、1、2、3、6个月和0、3、6、9、12、18、24个月时取样,进行小鼠效力、pH值、细菌内毒素和无菌测定。结果 3批疫苗原液于4℃保存6个月,表面抗原S、PreS1、PreS2抗原滴度及HPLC纯度均无明显变化;3批疫苗成品于25℃放置6个月和4℃放置24个月,各个时间点的小鼠效力均符合暂定规程的要求,pH值保持稳定,细菌内毒素和无菌试验均符合《中国药典》三部(2005和2010版)要求。结论毕赤酵母表达的含前S抗原重组乙型肝炎疫苗原液及成品稳定性良好。

两种不同配方含前S表位乙型肝炎疫苗的免疫原性及抗原活性比较

目的对共表达的含前S1(PreS1)和前S2(PreS2)表位的乙肝表面抗原(SS1S2)及分别表达的含PreS1表位乙肝表面抗原(SS1)和含PreS2表位乙肝表面抗原(SS2)混合物的免疫原性及抗原活性进行比较,为疫苗配方的选择提供依据。方法将SS1S2抗原、SS1抗原与SS2抗原的混合物(1∶1混合,以下简称SS1+SS2)分别用氢氧化铝佐剂吸附,制成SS1S2疫苗和SS1+SS2疫苗,总抗原含量均为20μg/ml,分别经BALB/c小鼠腹腔单次注射两种疫苗1.0、0.25和0.06μg,免疫后1、2、4周采血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中HBV S、PreS1和PreS2抗体水平。分别以纯化的SS1抗原或SS2抗原为参考品,采用ELISA法检测6批SS1S2抗原所对应的SS1或SS2抗原含量。结果免后1、2、4周,3个剂量的SS1S2疫苗S抗体阳转率均高于同剂量的SS1+SS2疫苗,0.25μg剂量的SS1S2疫苗PreS1抗体阳转率高于同剂量的SS1+SS2疫苗;免后1、2周,3个剂量的SS1S2疫苗PreS2抗体阳转率与SS1+SS2疫苗相近;免后4周,1.0和0.25μg剂量的SS1S2疫苗PreS2抗体阳转率高于SS1+SS2疫苗。免后4周,3个剂量的SS1S2疫苗的S和PreS1几何抗体平均滴度(GMT)均高于同剂量的SS1+SS2疫苗;1.0和0.25μg剂量的SS1S2疫苗的PreS2抗体GMT高于同剂量的SS1+SS2疫苗。6批SS1S2抗原中,每10μg SS1S2抗原所包含的PreS1抗原活性相当于(12.1±0.84)μg的SS1,每10μg SS1S2抗原所包含的PreS2抗原活性相当于(7.0±0.52)μg的SS2;SS1S2抗原中SS1和SS2抗原活性之和远超过100%。结论共表达的SS1S2抗原比单独表达的SS1抗原、SS2抗原具有更强的免疫原性;共表达的SS1S2抗原中PreS1和PreS2抗原活性也得到增强。

小鼠血清乙型肝炎病毒前S1抗体间接ELISA检测方法的建立和验证

目的 建立小鼠血清乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）前S1抗体的间接ELISA检测方法.方法 以合成的HBV前S1（21-47位氨基酸）多肽包被酶标板,利用方阵滴定法确定间接ELISA方法的最适工作条件,对该法的精密度、特异性和灵敏度进行验证,并与商品化试剂盒进行比较.结果 确定最佳抗原包被浓度为1.0 mg/L,血清稀释度为1∶10.该方法的特异性、灵敏度和精密度均符合检测要求.本法与商品化前S1抗体检测试剂盒测定结果的符合率为98.0％.结论 成功建立了HBV前S1抗体间接ELISA方法,可用于小鼠血清中前S1抗体的检测.

C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原的原核表达及免疫原性

目的 原核表达C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B virus core antigen,HBcAg）[HBcAg（aa 1-149）],并研究其在小鼠中的免疫原性.方法 用聚合酶链反应扩增C端截去34个氨基酸的HBcAg基因片段,构建含HBcAg（aa 1-149）基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌Rossatta2中以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白的表达.表达产物经Ni2＋亲和层析柱纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹法鉴定.将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,用ELISA法检测血清抗-HBc水平.结果 重组原核表达质粒pET15bHBcAg（aa 1-149）经双酶切和SDS-PAGE鉴定证明构建正确.重组HBcAg（aa 1-149）在大肠杆菌中获得高效表达,表达形式主要为可溶性蛋白.蛋白质印迹法显示在预期位置（相对分子质量约17 000位置）出现特异性条带.纯化后的重组蛋白纯度较高（＞90％）,并可在小鼠中诱生较高水平的抗-HBc.结论 重组HBcAg（aa 1-149）在原核系统中获得成功表达,并可在小鼠中诱导抗体应答.