SiRNA沉默JAB1表达抑制肝癌细胞增殖

目的观察沉默JAB1基因表达对人肝癌细胞HepG-2增殖的影响。方法利用RNA干扰技术构建pAVU6-JAB1 siRNA干扰质粒,将其转染HepG-2细胞,采用real-time PCR、Western blot等方法对JAB1表达进行检测,WST-8、流式细胞分析对细胞增殖的影响。结果成功构建pAVU6-JAB1 siRNA干扰质粒,转染HepG-2细胞后JAB1蛋白表达量较对照组明显降低,P27kip1蛋白表达量明显升高(P<0.01)。转染96 h后能显著抑制细胞增殖活性,由空载体转染组的99.6%±1.4%降至70.8%±1.6%。结论构建靶向JAB1基因的干扰质粒能下调JAB1基因的表达,上调P27kip1蛋白水平,并抑制HepG-2细胞在体外的增殖活性。

人免疫球蛋白白喉抗体国家标准品的协作标定

目的协作标定人免疫球蛋白白喉抗体国家标准品。方法用世界卫生组织提供的白喉抗毒素国际标准品(批号:9897/762)为标准,采用被动血凝法标定我国人免疫球蛋白白喉抗体国家标准品,将待标品按标示量加水溶解后,置于4℃保存6个月和将冻干待标品分别置于4,25,37℃保存6个月,进行稳定性考查。结果人免疫球蛋白白喉抗体国家标准品的效价为0.4 HAU/支,稳定性好,其他项目符合国家标准品要求。结论该批冻干人免疫球蛋白白喉抗体国家标准品可取代上批国家标准品。

IL-27亚基基因真核表达质粒的构建与表达

目的克隆人白细胞介素27(interleukin 27,IL-27)蛋白亚基EB病毒诱导的基因3(Epstein-Barr vi-rus-induced gene 3,EBI3)与p28基因的cDNA,分别构建其真核表达质粒并在COS-7细胞表达。方法人外周血单核细胞诱导为成熟树突状细胞后提取细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增EBI3与p28基因cDNA,酶切后插入pcDNA-3.1构建真核表达载体pcDNA-EBI3与pcDNA-p28。重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR检测目的基因表达。结果成功构建克隆人IL-27蛋白亚基真核表达质粒,重组质粒分别转染COS-7细胞后检测到相应基因表达。结论人IL-27蛋白亚基基因克隆及真核表达质粒的成功构建,为构建表达有生物学活性的重组人单链IL-27蛋白奠定基础。

小干涉RNA质粒抑制Fn14表达对肝癌细胞增殖的影响

目的观察成纤维细胞生长因子诱导的早期反应蛋白14(Fibroblast growthfactor-inducible immediate-earlyresponse protein 14、Fn14)表达对肝癌细胞增殖的影响。方法构建PAVU6-Fn14 siRNA干涉质粒并将其转染肝癌细胞株QGY7703,MTT法检测抑制Fn14蛋白表达对肝癌细胞增殖的影响,在培养体系加入肿瘤坏死因子相关弱凋亡诱导因子(Tumor necrosis factor related weakinducer of apoptosis、TWEAK)蛋白后检测肝癌细胞增殖活性。结果成功构建PAVU6-Fn14 siRNA干涉质粒,转化肝癌细胞后肝癌细胞增殖受抑,培养体系加入TWEAK蛋白后肝癌细胞增殖活性仍受抑。结论Fn14蛋白表达降低可抑制肝癌细胞的增殖活性,应用RNA干涉技术抑制Fn14表达对肝癌细胞增殖具抑制作用。

腺病毒介导重组人单链IL-27融合基因在肝癌细胞的表达及活性鉴定

目的:利用腺病毒表达系统在肝癌细胞表达有生物活性的单链重组人白细胞介素-27(rhscIL-27)并检测其生物学活性。方法:将rhscIL-27基因片段从pcDNA3.1载体克隆到腺病毒载体pAdTrack-CMV,然后在细菌内与pAdEasy同源重组构建AdIL-27腺病毒载体并转染293细胞包装、扩增腺病毒颗粒。将重组腺病毒感染肝癌细胞株HepG2,荧光显微镜、RT-PCR及ELISA等方法进行检测蛋白表达情况,IFN-γ诱生实验检测rhscIL-27的生物学活性。结果:成功构建AdIL-27腺病毒载体,经293细胞包装扩增后感染HepG2细胞观察到有GFP表达,RT-PCR及ELISA检测到细胞有rhscIL-27表达,IFN-γ诱生实验证实表达的rhscIL-27具有诱导产生IFN-γ的生物学活性。结论:利用腺病毒表达系统成功在肝癌细胞表达有生物活性的重组人单链IL-27(rhscIL-27),并具有诱导产生IFN-γ的生物学活性,为研究IL-27的生物学功能及其对肝癌的基因治疗奠定了基础。

抗-HBs国家标准品的研制

目的:协作标定首批冻干抗-HBs 国家标准品。方法:以首批抗-HBs 国际标准品(17—2—77批号)为标准,采用放射免疫法标定我国抗-HBs 国家标准品。结果:国家标准品(人免疫球蛋白)的效价为2.5 IU·支^(-1),抗-HBs 国家标准品(人血浆)的效价为1.3 IU·支^(-1)。将以上标准品按标示量加水溶解后于4℃放置9 d 和将冻干标准品分别置于4,23,45℃保存6个月,进行稳定性考察。研制的首批冻干抗-HBs 国家标准品稳定性良好,其他项目符合国家标准品要求。结论:已制备首批抗-HBs 国家标准品,并获得国家标准品批准文号。

注射用盐酸万古霉素的无菌实验方法学研究

目的:建立注射用盐酸万古霉素无菌检查的方法。方法:选用不同溶剂、稀释剂及冲洗量,用薄膜过滤法对注射用盐酸万古霉素进行无菌检查。结果:以灭菌水为溶剂,以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗剂,冲洗量为500mL的方法可获满意结果。结论:该方法灵敏,结果准确,可作为注射用盐酸万古霉素无菌检查的方法。

重组人单链IL-27融合基因的构建、表达及生物学活性鉴定

白细胞介素（IL）-27是近年发现的IL—12细胞因子超家族的新成员，是由IL-27 p28和IL-27 EB病毒诱导的基因3蛋白（Epstein—Barr virus—induced gene 3，EBI3）亚单位构成的可溶性异源二聚体，实验发现IL-27具较强促进细胞免疫与诱导杀伤肿瘤细胞的生物学活性。由于编码EBB与p28的基因分别位于不同的染色体，接受不同启动子和增强子的调节，因此只有当EBI3和p28同时表达并以1：1形式构成异二聚体蛋白时才具良好生物学活性。

衰变加速因子及其所在膜微区在T淋巴细胞信号传递中的作用

低温抽提Jurkat细胞膜去污剂抗性的膜成分(DIG),检测Src家族酪氨酸激酶(PTK)及衰变加速因子(DAF)的分布情况。共聚焦扫描显微技术检测Jurkat细胞静息与交联状态下DAF分子对去污剂Triton-X100的抗溶性,以探讨其在Jur-kat细胞免疫识别中的作用,结果显示静息状态CD3对去污剂无抗溶性,而DAF与Lck有抗溶性。单抗交联后CD3对去污剂抗性有所增加。静息状态DAF与Src家族PTK特异分布于膜微区中,交联CD3可诱导CD3与膜微区特异性聚集,DAF所在的膜微区可能促进T细胞的免疫识别和信号传递作用。

用于人凝血因子Ⅷ生产的DEAE 650M层析凝胶使用寿命的评价

目的评价用于人凝血因子Ⅷ生产的DEAE 650M层析凝胶的使用寿命。方法在人凝血因子Ⅷ生产用DEAE 650M凝胶层析系统基础上,将柱体积缩小353倍,建立DEAE 650M凝胶层析柱缩小模型。采用该模型连续层析10批次人凝血因子Ⅷ样品,每次层析前均用1 mol/mL的NaCl上样,检测理论塔板数和对称系数,以确认柱效;同时分析样品比活性、层析收率、层析纯化倍数、层析上样比例。结果 DEAE 650M凝胶层析缩小模型每次层析人凝血因子Ⅷ样品前,理论塔板数均> 2 000,对称系数均在1. 0~1. 4范围内;纯化后样品比活性均高于20 IU/mg,层析收率均高于40%,层析纯化倍数均大于20倍,层析上样比例均大于25 IU/mL。结论 DEAE 650M凝胶用于人凝血因子Ⅷ生产至少可循环使用10次。