案例式教学在兽医专业临床见习禽病教学环节中的应用

《临床见习》课程是兽医专业本科及硕士阶段学生重要的临床实践性课程,也是近年来国家执业兽医资格考试综合性科目的主要考核内容。长期以来,该门课程所采取的传统教学模式已难以适应实用化、现代化和国际化人才培养的要求,必须进行改革。本文介绍了我校以该课程禽病教学环节为例建立的案例教学模式和具体应用效果。通过案例式教学,《临床见习》课程初步成为了一门有自身特色、教学内容生动、教学方法与手段先进、考核方式新颖、教学理念较好的实践性课程,提升了学生实践能力、创新意识和综合素质,也为其他相关专业实践课程的教学改革起到了一定的示范作用。

两株马立克病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析

为了解国内鸡群马立克病毒(MDV)流行毒株的分子特征,采用细胞培养法对马立克病疑似病鸡抗凝血进行MDV分离,间接荧光法鉴定MDV血清型,PCR扩增分离病毒的meq和pp38两个主要致病基因,所得序列与MDV参考毒株的序列进行比对分析。结果显示,共分离鉴定出2株MDV I型毒株,分别命名为JS0316和JS0424。meq基因编码的氨基酸序列结果显示,2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征(A71S、P194-),具有MDV强毒分离株的分子特征(D80Y、V115A、T139A、P176R和P217A)。同时,JS0316 Meq蛋白出现Q93R和V123A突变,pp38蛋白出现L98I和F240S突变,而JS0424 Meq蛋白出现P217T突变,pp38蛋白出现W67G和V210A突变。因此,2株MDV均具有国内流行强毒株的分子特征,同时存在新的基因突变。

稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。

长时间血清饥饿胁迫对猪骨骼肌卫星细胞代谢和自噬的影响

为了探究长时间、不同程度饥饿胁迫条件对原代猪骨骼肌卫星细胞(SMSCs)代谢和自噬的影响,本试验通过控制SMSCs培养体系中血清浓度以形成不同程度饥饿胁迫,其中20%血清培养浓度为正常对照组,15%、10%、5%和0%血清培养浓度为试验组。细胞培养96 h后,通过流式细胞术检测各组细胞凋亡率、线粒体膜电位和活性氧(ROS)水平,通过ATP检测试剂盒测定细胞内ATP水平,通过Western blot检测各组细胞蛋白中自噬标志蛋白LC3b、p62以及AMPK-mTOR自噬信号通路中p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR蛋白的表达。结果显示,与20%血清组相比,0%血清和5%血清细胞凋亡率极显著上调(P<0.01),10%血清组细胞凋亡率显著上调(P<0.05);各试验组线粒体膜电位均极显著下降(P<0.01),ROS水平和ATP水平均极显著上调(P<0.01);细胞中LC3b蛋白的相对表达量随血清浓度降低而升高,p62蛋白的相对表达量随血清浓度降低而降低;p-mTOR/mTOR比值随血清浓度降低而降低,p-AMPK/AMPK比值随血清浓度降低而升高。结果表明,通过长期减少SMSCs培养体系中血清浓度,可以促进细胞代谢加快和凋亡发生,并且通过AMPK/mTOR信号通路激发细胞发生自噬,上述变化的程度与血清减少的程度呈正相关。本试验为后续探索不同程度饥饿胁迫对动物肌肉发育影响的研究提供理论依据。

动物性食品微生物检验实验课教学的实践与体会

动物性食品微生物检验是动植物检验与检疫专业的一门必修课,实践性很强,而实验课在整个课程体系中占有十分重要的位置。本文结合作者近十年来承担实验课教学的实践体会,从实验材料选择、如何设置致病菌的生化特性鉴别实验项目、合理安排时间保证综合性实验的有效开展以及将实验教学内容与本科生研究性学习相结合等四个方面进行了系统性总结,这些经验的集成为今后进一步改进实验教学方法、提高实验课教学质量、增强本专业学生解决实际问题的能力奠定了坚实基础。

邻近标记技术在弓形虫蛋白质组学研究中的应用进展

弓形虫编码数量众多的分泌蛋白,储存在微线体、棒状体和致密颗粒等虫体特有的细胞器中,于虫体入侵宿主细胞前后分泌到不同部位,并在虫体的感染、寄生和致病过程中发挥重要作用,对这些分泌蛋白的鉴定和功能研究是弓形虫致病机制研究中的热点和难点。传统的蛋白质组学技术在弓形虫亚细胞器的分离和组分鉴定上存在样品纯化困难和蛋白质组学信息覆盖率低等不足,且该技术在检测瞬时的或较弱的蛋白质相互作用时灵敏性较低。近年来,快速发展的邻近标记技术(PL)克服了传统技术的局限性。PL是将具有特定催化活性的工具酶与诱饵蛋白进行融合,进而添加生物素或生物素苯酚对诱饵蛋白邻近的靶蛋白进行生物素酰化标记的一门技术。该技术整合了酶促反应效率高的优点,可将特定空间内的蛋白进行高效标记,并可检测较弱的蛋白质相互作用,近年来在生物学研究中被广泛使用。本文对基于生物素连接酶(BirA)和抗坏血酸过氧化物酶(APEX)催化的PL在弓形虫蛋白质组学研究中的应用进行阐述,介绍2种标记方法在弓形虫分泌蛋白的挖掘和蛋白质相互作用研究中的贡献,为弓形虫致病机制的研究和弓形虫病的防控提供参考。

铁死亡在细菌性感染中的研究进展

铁死亡是一种新型程序性细胞死亡模式,其主要特点为铁依赖的脂质过氧化物蓄积。在细菌感染宿主细胞的过程中,铁代谢紊乱和氧化应激起到了重要作用,并且已经证明某些细菌可通过铁死亡的方式诱导宿主细胞死亡。本文就细菌感染对宿主铁代谢的影响以及细菌诱导铁死亡的研究现状进行阐述,以期为防控动物细菌感染提供新的思路。

规模化牧场154株奶牛乳腺炎源大肠杆菌的耐药性分析

为了解规模化牧场中奶牛乳腺炎源大肠杆菌的耐药性,试验采集安徽、福建、广东、江苏及内蒙古等省(自治区)的11个规模化牧场的临床型乳腺炎奶牛的乳样进行细菌分离纯化,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)方法对分离株进行鉴定,采用K-B纸片扩散法检测大肠杆菌对11种常用抗生素的耐药性。对乳腺炎源大肠杆菌多重耐药性及不同地区大肠杆菌的耐药性进行分析。结果表明:共分离到154株大肠杆菌,分离率为22.95%,其中安徽60株,广东42株,福建22株,江苏16株,内蒙古10株,其他地区4株。154株大肠杆菌对青霉素、阿莫西林、链霉素、氨苄西林耐药性较强,耐药率分别为98.05%、61.69%、42.21%、40.91%;对庆大霉素、环丙沙星、氟苯尼考和阿米卡星相对敏感,敏感率分别为90.26%、73.38%、68.83%和61.04%;经多重耐药性分析,90株(占58.44%)大肠杆菌对3种及以上抗生素耐药,其中30株大肠杆菌对6种抗生素耐药;多重耐药菌株中,耐药谱为氨苄西林(AMP)-青霉素(PEN)-阿莫西林(AMX)-头孢氨苄(LEX)-四环素(STR)-链霉素(TCY)的大肠杆菌菌株最多,占18.83%;大肠杆菌耐药性在不同地区间存在差异,其中安徽、福建和内蒙古地区奶牛乳腺炎源大肠杆菌耐药性比较严重。说明奶牛乳腺炎源大肠杆菌在我国规模化牧场中具有明显的多重耐药性,提示牧场在生产中应加强饲养管理,合理使用药物。

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及小鼠致病性的研究

为了初步了解从江苏某屠宰场分离鉴定出的一株猪源H1N1亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Jiangsu/1070/2019(H1N1)的6致病性,对该分离株纯化后进行全基因序列分析,测定其生物学特性,并以10 EID50病毒感染BALB/c小鼠。序列分析结果显示,该病毒HA基因的裂解位点为339PSIQSR↓G347,符合低致病性SIV的分子特征,与A/Swine/Jiangsu/J006/2018(H1N1)同源性最高达到98.94%,NA基因与A/Swine/Shandong/LY142/2017(H1N1)同源性最高达到98.79%,内部基因PB2、PB1、PA、M、NP和NS分别与2018年出现的不同猪源H1N1亚型具有高同源性,因此该病毒是一株在猪体内重组的病毒;病毒在鸡胚上的半数感染量(EID50)为10-8.5/0.1 mL,在MDCK细胞上的半数感染量(TCID50)为10-5.22/0.1 mL;小鼠致病性结果显示,该病毒除可导致小鼠体重下降外,还具有致死小鼠的能力,小鼠的致死率约为33.3%,其能够在小鼠的肺脏和心脏中复制,滴度分布达到2.91±0.19 lg EID50/mL和2.37±0.29 lg EID50/mL,感染后可造成小鼠肺部组织发生严重炎性反应,并导致炎性相关细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的表达水平明显上调(P<0.01)。综上表明该毒株为新型重组病毒,对小鼠具有一定致病性,为H1N1亚型猪流感的预警和防控提供一定的参考依据。

番鸭细小病毒鹅胚化弱毒株FZ91-30的全基因组克隆及序列分析

通过酶切番鸭细小病毒（MPDV）鹅胚化弱毒株FZ91—30基因组DNA，将各片段分别克隆入载体质粒pBluescriptⅡ（SK）并进行测序。序列分析表明FZ91—30基因组由5131个碱基组成，5’端和3’端具有一致的末端倒置重复序列（ITR），均由456个碱基组成，包括370个碱基配对形成的回文茎部、45个碱基构成的Bubble区以及41个碱基组成的D序列，5’端ITR的D序列和3’端ITR的D’序列反向互补。FZ91—30疫苗株与已发表的5个MPDV毒株VP1蛋白氨基酸序列同源性在97．8％～98．8％，FZ91—30疫苗株在6个位点发生了氨基酸突变，而所有强毒株在这些位点均高度保守，预示这些突变与FZ91—30株对雏番鸭的毒力减弱有关。

15株禽源沙门菌的分离鉴定与耐药性试验

本试验旨在对沙门菌临床分离株进行鉴定及其耐药性进行研究。通过收集2012年2月-7月间具有典型沙门菌病病变特征的病例,无菌采集病死禽的肝脏、心、卵巢等脏器接种血清营养琼脂培养基,以麦康凯琼脂培养基纯化分离菌,并检测其生化特点,16S rDNA基因测序法快速鉴定分离菌株,然后进一步鉴定血清型;同时用15种抗菌药物进行药敏试验。结果显示,有15株细菌在麦康凯琼脂培养基上为无色、透明的菌落,能利用葡萄糖、甘露醇,不发酵乳糖、蔗糖,符合沙门菌的生化特性。同时,15株沙门菌的16S rDNA序列分析结果显示,分离株的同源性达到97%以上。15株沙门菌的血清学试验结果显示,有7株鼠伤寒沙门菌、5株伤寒沙门菌、2株肠炎沙门菌、1株鸡白痢沙门菌。药敏试验结果显示,分离细菌对链霉素、萘啶酸、强力霉素和美洛西林耐药率高。

鹅细小病毒鹅胚化疫苗株SYG61v对雏鹅毒力减弱的遗传基础分析

本研究对鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)SYG61v弱毒疫苗株与5个分离于不同年代的GPV强毒株,在编码蛋白氨基酸序列及非编码调控区碱基序列进行了比对,确定了SYG61v的特征性突变位点,而5个强毒株中这些位点均高度保守。SYG61v株的VP1和Rep1蛋白,分别产生了11个和10个氨基酸位点突变。Rep1的10个突变氨基酸中,7个均处于Rep1蛋白羧基端的100个氨基酸范围内,而VP1蛋白中的10个突变氨基酸中,推测仅有1个位点处于病毒衣壳表面。在左侧末端倒置重复序列(inverted terminal repeat,ITR)与P9启动子之间非编码区,存在两段共7个碱基的连续碱基突变。SYG61v弱毒株中突变位点的确认为进一步明确他们各自在弱毒株毒力减弱中的作用奠定了基础。

鸡痛风的组织病理学观察

对江苏某蛋鸡养殖场发生内脏型痛风的病鸡进行病理学观察,结果显示,患鸡内脏器官表面沉着了大量白色石灰状尿酸盐,肾脏、肝脏和脾脏切面上可见密布的白色结节;内脏器官的组织切片内可见痛风结节,但以肾脏病理变化较重;此外,在不同组织的大血管壁周围可见大量尿酸盐沉积,暗示尿酸盐沉积可影响机体的血液循环,促进病鸡的发病死亡。

头孢洛宁乳房注入剂防治干乳期奶牛乳腺炎的药效学研究

为了探讨头孢洛宁乳房注入剂对干乳期乳腺炎的防治作用,本研究采用微量稀释法测定比较了头孢洛宁、头孢匹林、阿莫西林和氯唑西林对乳腺炎病原菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌)的体外抗菌活性;并且,随机选择 60头进入干乳期的临床健康奶牛,在最后一次挤奶后每头牛的每个乳区分别灌注一管受试药物或对照药物(氨苄西林-苄星氯唑西林乳房注入剂)。对入选的每头奶牛分别在干奶前、以及产后1、3、5d,采集每个乳区的乳样进行体细胞计数和细菌学检查。在药物处理后至产后14d 内,每天对受试动物进行临床型乳腺炎检查。结果显示,头孢洛宁、头孢匹林、阿莫西林、氯唑西林对分离自奶牛乳腺炎的大肠杆菌 MIC50分别为 4、8、8μg/mL >128 μg/mL;对金黄色葡萄球菌的 MIC50分别为 0.125、0.25、2、1 μg/mL;对乳房链球菌的 MIC50分别为 4、8、16、128 μg/mL;对停乳链球菌的 MIC50分别为 8、8、8、128 μg/mL;对无乳链球菌 MIC50分别为 0.25、4、0.25、32 μg/mL。临床药学研究显示,头孢洛宁乳房注入剂对于乳期奶牛乳腺炎具有良好的防治效果,对不同细菌感染治愈率介于 66.6%~100%之间,新感染发生率低于 8.3%。在治愈率、新感染率及细菌学清除率方面和对照药物(氨苄西林-苄星氯唑西林乳房注入剂)相比均无显著性差异。表明头孢洛宁对引起奶牛乳腺炎的主要病原菌均具有良好的抗菌活性,干乳期奶牛每乳区灌注一管 250mg 的头孢洛宁干乳期乳房注入剂能有效治疗干乳期隐性乳腺炎和预防新的乳腺炎感染。

中西药治疗犬细小病毒病的病理学观察

为了观察苦参止痢颗粒对犬细小病毒病的治疗作用,试验以水平感染的犬作为动物模型,将其分为中药组、西药组、阳性组和空白组,用苦参止痢颗粒和西药进行治疗,观察临床症状、病理解剖和组织病理学切片。结果表明:苦参止痢颗粒和西药都能控制犬细小病毒病,其中中药组没有出现血痢症状,组织病理学切片观察肠道组织也没有明显出血,并且维持了肠绒毛结构的完整性。说明苦参止痢颗粒能抑制犬细小病毒引起的肠黏膜损伤和出血性病变,对犬细小病毒病可达到治愈的作用。

巨噬细胞特异的人工miRNA表达载体的构建与鉴定

根据小RNA（microRNA,miRNA）前体分子结构特点而设计并合成的人工miRNA（artificial miRNA,amiRNA）也可以在体内通过与内源miRNA相同或相似的途径发挥RNA干扰（RNA interference,RNAi）作用,目前amiRNA技术在调控基因表达、抗病毒领域得到了广泛应用[1-4]。

人工感染猫芮氏等孢球虫卵囊排出规律的观察

芮氏等孢球虫是引起猫球虫病的常见病原之一,可引起猫腹泻、呕吐、吸收障碍、体重减轻、免疫力低下等症状。鉴于目前对猫芮氏等孢球虫卵囊排出规律不甚了解,造成预防治疗效果不佳,本试验通过猫口服感染芮氏等孢球虫卵囊试验,监测了芮氏等孢球虫的排卵囊规律。结果显示,接种后d7在幼猫粪便中检出芮氏等孢球虫卵囊,d10猫粪便中卵囊数量达到一个小高峰,随后有所下降,d13排卵囊达到最高峰,随后卵囊排出数逐渐下降,d19粪检卵囊呈阴性,直至d23粪检卵囊仍然呈阴性。

仔猪传染性胃肠炎的PCR检测及组织病理学观察

对江苏某养殖场送检的3只病死腹泻仔猪进行临床观察、病理组织学观察,并结合病原学检测结果对患猪腹泻原因进行了分析。结果显示,剖检病死仔猪病变主要在胃和小肠,胃内有凝乳块,胃底部黏膜充血,小肠臌气,肠壁变薄。组织病理学变化主要为12指肠卡他性炎症,空肠肠绒毛显著萎缩,肠绒毛上皮变为扁平上皮且发生空泡变性,肠黏膜层局部坏死脱落,黏膜下层白细胞浸润;胃黏膜上皮变性、坏死脱落,固有层及黏膜下层充血及大量淋巴细胞浸润,局部胃黏膜层完全坏死,甚至形成溃疡;用针对K88、K99、987P、F41的单抗对分离到的大肠杆菌通过玻板凝集试验进行检测,结果显示为阴性。PCR检测结果为猪传染性胃肠炎病毒阳性。

猪喘气病自家苗的制备及其效果观察

为控制和预防猪支原体肺炎,试验采用常规方法制备自家喘气病灭活苗,通过自制自家苗与市场上常用的喘气病灭活苗进行免疫比较试验,并用ELISA法检测猪血清抗体水平。结果表明:自家苗的免疫效果可靠,可用于本场猪群的免疫。

3株樱桃谷鸭源新型鹅细小病毒的分离及分子特征解析

为了深入揭示引起樱桃谷鸭短喙与矮小综合征(SBDS)的新型鹅细小病毒(NGPV)的鹅胚增殖特性及分子特征,对从山东省不同地区采集的3份SBDS典型病例在9日龄鹅胚上进行了病毒分离,并对其全基因组序列及编码蛋白序列进行比对。结果成功分离到3株NGPV,分别为SDHT16、SDJN19和SDLC19。3株病毒均能在鹅胚中稳定传代,但致死鹅胚的时间明显长于经典型GPV。3株NGPV之间基因组的同源性高达98.9%~99.7%,而与经典GPV强毒株的同源性则稍低,为95.2%~96.1%。基于3株NGPV与已发表的NGPV毒株和经典GPV强毒株的编码蛋白比对分析显示,与国内经典GPV强毒株相比,NGPV毒株结构蛋白VP1共产生了16个氨基酸点突变,其中9个氨基酸位点与欧洲的B株相同;非结构蛋白Rep1则产生了12个氨基酸位点突变。与经典GPV LH株的末端倒置重复序列(ITR)相比,SDHT16、SDJN19和SDLC19在ITR的回文区茎部分别多出2、4、4个碱基,ITR的同源性达到98.1%~100.0%,而与LH株的同源性为93.0%~94.0%。本研究结果为今后进一步深入研究NGPV的致病机制奠定了基础。