猪繁殖与呼吸综合征病毒接触感染仔猪模型的建立

为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)接触感染模型,将易感仔猪与PRRSV人工感染仔猪在隔离器中同居饲养,每日观察记录体温变化和临床症状,定期采集血清和粪便样品,用荧光定量RT-PCR检测病毒血症和粪便排毒水平;对病死猪和试验结束迫杀猪进行剖检和肺脏组织病理学检查,并检测各器官病毒载量和组织分布。结果显示:接触感染仔猪出现高热和PRRS症状时间分别较人工接种猪推迟2~3d;第3天起血清检测PRRSV阳性,第10天病毒血症上升至较高水平(108.6拷贝/mL);第5天起粪便检测PRRSV阳性,第7天粪便排毒量上升至较高水平(103.9拷贝/0.1g);3头接触感染仔猪分别于同居后第12天和第13天死亡,较人工接种猪推迟1~2d,病死猪的主要器官病毒载量以及剖检和肺脏显微病理变化与人工接种病死猪相似。这些结果表明,本研究建立的接触感染仔猪模型可用于PRRS疫苗免疫效果评价。

奶牛乳房炎葡萄球菌菌种的鉴定及其mecA基因与耐药性关系分析

从209份奶牛乳房炎阳性乳样分离葡萄球菌,用PCR扩增Tuf和16S rRNA基因片段,根据序列同源性进行种的鉴定,用PCR检测mecA基因,用标准方法进行药敏试验。结果显示,分离的104株葡萄球菌分为14个种,包括金黄色葡萄球菌和13种凝固酶阴性葡萄球菌,后者主要为阿氏葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌和产色葡萄球菌,不同于国外的研究报道;松鼠葡萄球菌和溶血葡萄球菌的mecA基因检出率高达66.7%,表皮葡萄球菌达42.9%,金黄色葡萄球菌达35.7%,显著高于国内外报道;大部分葡萄球菌的β-内酰胺类抗生素耐药性与mecA基因检测不相符,可能与其他mec基因有关。

重组P128蛋白的表达纯化及其对抗牛源葡萄球菌活性研究

为了制备重组P128蛋白用于葡萄球菌性奶牛乳房炎治疗。将引入烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVp)识别位点的P128编码序列插入类弹性蛋白多肽(ELP)融合表达载体,转化大肠杆菌后用IPTG诱导融合蛋白表达,用温度敏感相变循环纯化,用TEVp活性包涵体切割融合标签,用最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)试验测定重组P128对奶牛乳房炎葡萄球菌抗菌活性。结果显示,融合蛋白以可溶性蛋白表达,两次相变循环纯化后的纯度达90%,产量为400 mg/mL; TEVp活性包涵体切割融合标签的效率接近100%,回收的重组P128纯度达98%,对牛源葡萄球菌的MIC和MBC分别为0. 47μg/mL和1. 88μg/mL;除个别多重耐药菌株外,重组P128蛋白对多数金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌的溶(杀)作用很强。这些研究结果表明,重组P128可用于葡萄球菌性奶牛乳房炎治疗。

类弹性蛋白多肽融合犬β干扰素的表达纯化和抗病毒活性及体外半衰期的研究

为了研制长效犬β干扰素(Ca IFNb)基因工程产品,用聚合酶链反应从犬基因组DNA扩增Ca IFNb成熟肽编码序列,插入类弹性蛋白多肽(ELP)融合表达载体,将重组载体转化大肠杆菌BLR(DE3),用IPTG诱导Ca IFNb-ELP表达,利用ELP介导的温度敏感可逆相变循环(ITC)进行纯化,用50%细胞病变抑制试验检测干扰素活性,用50%小鼠血浆孵育法检测体外半衰期,并与融合组氨酸标签的His-Ca IFNb进行比较。结果显示,在≤28℃条件下,90%Ca IFNb-ELP为可溶性表达,His-Ca IFNb以不溶性包涵体表达;在优化条件下进行1轮ITC,获得的Ca IFNb-ELP的纯度为96%,显著高于以包涵体纯化的His-Ca IFNb的纯度(85%);Ca IFNb-ELP的抗病毒活性为1×105 U/mg,比His-Ca IFNb的抗病毒活性高10倍;Ca IFNb-ELP的体外半衰期>24 h,显著长于His-Ca IFNb的体外半衰期(12 h)。结果表明,Ca IFNb-ELP具有表达水平高、纯化简单和体外半衰期较长等优点,有望作为长效干扰素开发利用。