两株马立克病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析

为了解国内鸡群马立克病毒(MDV)流行毒株的分子特征,采用细胞培养法对马立克病疑似病鸡抗凝血进行MDV分离,间接荧光法鉴定MDV血清型,PCR扩增分离病毒的meq和pp38两个主要致病基因,所得序列与MDV参考毒株的序列进行比对分析。结果显示,共分离鉴定出2株MDV I型毒株,分别命名为JS0316和JS0424。meq基因编码的氨基酸序列结果显示,2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征(A71S、P194-),具有MDV强毒分离株的分子特征(D80Y、V115A、T139A、P176R和P217A)。同时,JS0316 Meq蛋白出现Q93R和V123A突变,pp38蛋白出现L98I和F240S突变,而JS0424 Meq蛋白出现P217T突变,pp38蛋白出现W67G和V210A突变。因此,2株MDV均具有国内流行强毒株的分子特征,同时存在新的基因突变。

规模化牧场154株奶牛乳腺炎源大肠杆菌的耐药性分析

为了解规模化牧场中奶牛乳腺炎源大肠杆菌的耐药性,试验采集安徽、福建、广东、江苏及内蒙古等省(自治区)的11个规模化牧场的临床型乳腺炎奶牛的乳样进行细菌分离纯化,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)方法对分离株进行鉴定,采用K-B纸片扩散法检测大肠杆菌对11种常用抗生素的耐药性。对乳腺炎源大肠杆菌多重耐药性及不同地区大肠杆菌的耐药性进行分析。结果表明:共分离到154株大肠杆菌,分离率为22.95%,其中安徽60株,广东42株,福建22株,江苏16株,内蒙古10株,其他地区4株。154株大肠杆菌对青霉素、阿莫西林、链霉素、氨苄西林耐药性较强,耐药率分别为98.05%、61.69%、42.21%、40.91%;对庆大霉素、环丙沙星、氟苯尼考和阿米卡星相对敏感,敏感率分别为90.26%、73.38%、68.83%和61.04%;经多重耐药性分析,90株(占58.44%)大肠杆菌对3种及以上抗生素耐药,其中30株大肠杆菌对6种抗生素耐药;多重耐药菌株中,耐药谱为氨苄西林(AMP)-青霉素(PEN)-阿莫西林(AMX)-头孢氨苄(LEX)-四环素(STR)-链霉素(TCY)的大肠杆菌菌株最多,占18.83%;大肠杆菌耐药性在不同地区间存在差异,其中安徽、福建和内蒙古地区奶牛乳腺炎源大肠杆菌耐药性比较严重。说明奶牛乳腺炎源大肠杆菌在我国规模化牧场中具有明显的多重耐药性,提示牧场在生产中应加强饲养管理,合理使用药物。

铁死亡在细菌性感染中的研究进展

铁死亡是一种新型程序性细胞死亡模式,其主要特点为铁依赖的脂质过氧化物蓄积。在细菌感染宿主细胞的过程中,铁代谢紊乱和氧化应激起到了重要作用,并且已经证明某些细菌可通过铁死亡的方式诱导宿主细胞死亡。本文就细菌感染对宿主铁代谢的影响以及细菌诱导铁死亡的研究现状进行阐述,以期为防控动物细菌感染提供新的思路。

甲硫脑啡肽通过阿片受体促进脂多糖作用下奶牛子宫内膜基质细胞的增殖

为明确甲硫脑啡肽(Met-enkephalin,MENK)调控原代奶牛子宫内膜基质细胞(bovine endometrial stromal cell,BESC)增殖的作用机制,采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、MENK和阿片受体拮抗剂共处理细胞进行了本试验。本研究使用的阿片受体拮抗剂包括非选择性阿片受体拮抗剂纳洛酮(naloxone,Nx)、δ阿片受体拮抗剂ICI 154129和μ阿片受体拮抗剂CTAP,分组情况:空白对照组,LPS处理组,LPS与MENK(10-10mol·L^(-1))共处理组(LM组),LPS、MENK和阿片受体拮抗剂(Nx、CTAP和ICI 154129,均为10-10mol·L^(-1))共处理组以及LPS与阿片受体拮抗剂共处理组。检测细胞活性、细胞周期、细胞增殖相关因子基因表达以及Wnt/β-catenin和PI3K/AKT相关通路变化。结果表明:阿片受体拮抗剂单独或与LPS共处理细胞24 h,对细胞活力无影响(P>0.05)。与LM组相比,LPS、MENK和Nx共处理组(LMN组)以及LPS、MENK和ICI 154129共处理组(LMI组)的G1期相对细胞数升高(P<0.05),LMN组以及LPS、MENK和CTAP共处理组(LMC组)S期相对细胞数降低(P<0.05)。与LM组相比,LMN组和LMI组细胞CCN2、TGFB1和TGFB3基因表达下调(P<0.01),LMC组细胞CCN2基因表达下调(P<0.01)。与LM组相比,LMN组cyclinD1和GSK-3β蛋白表达上调(P<0.05),LMI组细胞β-catenin和GSK-3β蛋白表达上调(P<0.01),LMC组细胞cyclinD1蛋白表达上调(P<0.05);与LM组相比,LMN组、LMI组和LMC组AKT磷酸化水平升高(P<0.05)。以上结果说明,μ阿片受体和δ阿片受体均参与MENK对BESC的促增殖作用。

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及小鼠致病性的研究

为了初步了解从江苏某屠宰场分离鉴定出的一株猪源H1N1亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Jiangsu/1070/2019(H1N1)的6致病性,对该分离株纯化后进行全基因序列分析,测定其生物学特性,并以10 EID50病毒感染BALB/c小鼠。序列分析结果显示,该病毒HA基因的裂解位点为339PSIQSR↓G347,符合低致病性SIV的分子特征,与A/Swine/Jiangsu/J006/2018(H1N1)同源性最高达到98.94%,NA基因与A/Swine/Shandong/LY142/2017(H1N1)同源性最高达到98.79%,内部基因PB2、PB1、PA、M、NP和NS分别与2018年出现的不同猪源H1N1亚型具有高同源性,因此该病毒是一株在猪体内重组的病毒;病毒在鸡胚上的半数感染量(EID50)为10-8.5/0.1 mL,在MDCK细胞上的半数感染量(TCID50)为10-5.22/0.1 mL;小鼠致病性结果显示,该病毒除可导致小鼠体重下降外,还具有致死小鼠的能力,小鼠的致死率约为33.3%,其能够在小鼠的肺脏和心脏中复制,滴度分布达到2.91±0.19 lg EID50/mL和2.37±0.29 lg EID50/mL,感染后可造成小鼠肺部组织发生严重炎性反应,并导致炎性相关细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的表达水平明显上调(P<0.01)。综上表明该毒株为新型重组病毒,对小鼠具有一定致病性,为H1N1亚型猪流感的预警和防控提供一定的参考依据。

番鸭细小病毒鹅胚化弱毒株FZ91-30的全基因组克隆及序列分析

通过酶切番鸭细小病毒（MPDV）鹅胚化弱毒株FZ91—30基因组DNA，将各片段分别克隆入载体质粒pBluescriptⅡ（SK）并进行测序。序列分析表明FZ91—30基因组由5131个碱基组成，5’端和3’端具有一致的末端倒置重复序列（ITR），均由456个碱基组成，包括370个碱基配对形成的回文茎部、45个碱基构成的Bubble区以及41个碱基组成的D序列，5’端ITR的D序列和3’端ITR的D’序列反向互补。FZ91—30疫苗株与已发表的5个MPDV毒株VP1蛋白氨基酸序列同源性在97．8％～98．8％，FZ91—30疫苗株在6个位点发生了氨基酸突变，而所有强毒株在这些位点均高度保守，预示这些突变与FZ91—30株对雏番鸭的毒力减弱有关。

15株禽源沙门菌的分离鉴定与耐药性试验

本试验旨在对沙门菌临床分离株进行鉴定及其耐药性进行研究。通过收集2012年2月-7月间具有典型沙门菌病病变特征的病例,无菌采集病死禽的肝脏、心、卵巢等脏器接种血清营养琼脂培养基,以麦康凯琼脂培养基纯化分离菌,并检测其生化特点,16S rDNA基因测序法快速鉴定分离菌株,然后进一步鉴定血清型;同时用15种抗菌药物进行药敏试验。结果显示,有15株细菌在麦康凯琼脂培养基上为无色、透明的菌落,能利用葡萄糖、甘露醇,不发酵乳糖、蔗糖,符合沙门菌的生化特性。同时,15株沙门菌的16S rDNA序列分析结果显示,分离株的同源性达到97%以上。15株沙门菌的血清学试验结果显示,有7株鼠伤寒沙门菌、5株伤寒沙门菌、2株肠炎沙门菌、1株鸡白痢沙门菌。药敏试验结果显示,分离细菌对链霉素、萘啶酸、强力霉素和美洛西林耐药率高。

鹅细小病毒鹅胚化疫苗株SYG61v对雏鹅毒力减弱的遗传基础分析

本研究对鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)SYG61v弱毒疫苗株与5个分离于不同年代的GPV强毒株,在编码蛋白氨基酸序列及非编码调控区碱基序列进行了比对,确定了SYG61v的特征性突变位点,而5个强毒株中这些位点均高度保守。SYG61v株的VP1和Rep1蛋白,分别产生了11个和10个氨基酸位点突变。Rep1的10个突变氨基酸中,7个均处于Rep1蛋白羧基端的100个氨基酸范围内,而VP1蛋白中的10个突变氨基酸中,推测仅有1个位点处于病毒衣壳表面。在左侧末端倒置重复序列(inverted terminal repeat,ITR)与P9启动子之间非编码区,存在两段共7个碱基的连续碱基突变。SYG61v弱毒株中突变位点的确认为进一步明确他们各自在弱毒株毒力减弱中的作用奠定了基础。

鸡痛风的组织病理学观察

对江苏某蛋鸡养殖场发生内脏型痛风的病鸡进行病理学观察,结果显示,患鸡内脏器官表面沉着了大量白色石灰状尿酸盐,肾脏、肝脏和脾脏切面上可见密布的白色结节;内脏器官的组织切片内可见痛风结节,但以肾脏病理变化较重;此外,在不同组织的大血管壁周围可见大量尿酸盐沉积,暗示尿酸盐沉积可影响机体的血液循环,促进病鸡的发病死亡。

中西药治疗犬细小病毒病的病理学观察

为了观察苦参止痢颗粒对犬细小病毒病的治疗作用,试验以水平感染的犬作为动物模型,将其分为中药组、西药组、阳性组和空白组,用苦参止痢颗粒和西药进行治疗,观察临床症状、病理解剖和组织病理学切片。结果表明:苦参止痢颗粒和西药都能控制犬细小病毒病,其中中药组没有出现血痢症状,组织病理学切片观察肠道组织也没有明显出血,并且维持了肠绒毛结构的完整性。说明苦参止痢颗粒能抑制犬细小病毒引起的肠黏膜损伤和出血性病变,对犬细小病毒病可达到治愈的作用。

人工感染猫芮氏等孢球虫卵囊排出规律的观察

芮氏等孢球虫是引起猫球虫病的常见病原之一,可引起猫腹泻、呕吐、吸收障碍、体重减轻、免疫力低下等症状。鉴于目前对猫芮氏等孢球虫卵囊排出规律不甚了解,造成预防治疗效果不佳,本试验通过猫口服感染芮氏等孢球虫卵囊试验,监测了芮氏等孢球虫的排卵囊规律。结果显示,接种后d7在幼猫粪便中检出芮氏等孢球虫卵囊,d10猫粪便中卵囊数量达到一个小高峰,随后有所下降,d13排卵囊达到最高峰,随后卵囊排出数逐渐下降,d19粪检卵囊呈阴性,直至d23粪检卵囊仍然呈阴性。

动物性食品微生物检验实验课教学的实践与体会

动物性食品微生物检验是动植物检验与检疫专业的一门必修课,实践性很强,而实验课在整个课程体系中占有十分重要的位置。本文结合作者近十年来承担实验课教学的实践体会,从实验材料选择、如何设置致病菌的生化特性鉴别实验项目、合理安排时间保证综合性实验的有效开展以及将实验教学内容与本科生研究性学习相结合等四个方面进行了系统性总结,这些经验的集成为今后进一步改进实验教学方法、提高实验课教学质量、增强本专业学生解决实际问题的能力奠定了坚实基础。

仔猪传染性胃肠炎的PCR检测及组织病理学观察

对江苏某养殖场送检的3只病死腹泻仔猪进行临床观察、病理组织学观察,并结合病原学检测结果对患猪腹泻原因进行了分析。结果显示,剖检病死仔猪病变主要在胃和小肠,胃内有凝乳块,胃底部黏膜充血,小肠臌气,肠壁变薄。组织病理学变化主要为12指肠卡他性炎症,空肠肠绒毛显著萎缩,肠绒毛上皮变为扁平上皮且发生空泡变性,肠黏膜层局部坏死脱落,黏膜下层白细胞浸润;胃黏膜上皮变性、坏死脱落,固有层及黏膜下层充血及大量淋巴细胞浸润,局部胃黏膜层完全坏死,甚至形成溃疡;用针对K88、K99、987P、F41的单抗对分离到的大肠杆菌通过玻板凝集试验进行检测,结果显示为阴性。PCR检测结果为猪传染性胃肠炎病毒阳性。

猪喘气病自家苗的制备及其效果观察

为控制和预防猪支原体肺炎,试验采用常规方法制备自家喘气病灭活苗,通过自制自家苗与市场上常用的喘气病灭活苗进行免疫比较试验,并用ELISA法检测猪血清抗体水平。结果表明:自家苗的免疫效果可靠,可用于本场猪群的免疫。

3株樱桃谷鸭源新型鹅细小病毒的分离及分子特征解析

为了深入揭示引起樱桃谷鸭短喙与矮小综合征(SBDS)的新型鹅细小病毒(NGPV)的鹅胚增殖特性及分子特征,对从山东省不同地区采集的3份SBDS典型病例在9日龄鹅胚上进行了病毒分离,并对其全基因组序列及编码蛋白序列进行比对。结果成功分离到3株NGPV,分别为SDHT16、SDJN19和SDLC19。3株病毒均能在鹅胚中稳定传代,但致死鹅胚的时间明显长于经典型GPV。3株NGPV之间基因组的同源性高达98.9%~99.7%,而与经典GPV强毒株的同源性则稍低,为95.2%~96.1%。基于3株NGPV与已发表的NGPV毒株和经典GPV强毒株的编码蛋白比对分析显示,与国内经典GPV强毒株相比,NGPV毒株结构蛋白VP1共产生了16个氨基酸点突变,其中9个氨基酸位点与欧洲的B株相同;非结构蛋白Rep1则产生了12个氨基酸位点突变。与经典GPV LH株的末端倒置重复序列(ITR)相比,SDHT16、SDJN19和SDLC19在ITR的回文区茎部分别多出2、4、4个碱基,ITR的同源性达到98.1%~100.0%,而与LH株的同源性为93.0%~94.0%。本研究结果为今后进一步深入研究NGPV的致病机制奠定了基础。

弓形虫荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

根据Gen Bank中龚地弓形虫529 bp重复序列设计引物,以弓形虫RH株基因组DNA为模板,常规PCR扩增出长度212 bp的特异性保守序列,将其克隆到p GEM-T Easy载体中构建重组质粒标准品;以10倍倍比稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立弓形虫荧光定量PCR检测方法。将该方法用于临床病死猪的弓形虫检测。结果表明:用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,溶解曲线特异相关系数0.997,平均试验间变异系数2.30%,能检出约0.05个速殖子;检测弓形虫YZ-1株与YZ-2株均为阳性,而检测水牛梭形肉孢子虫、犬等孢球虫、柔嫩艾美耳球虫基因组DNA均为阴性;检测24头病死猪,弓形虫阳性率为70.8%,略高于常规PCR方法的检出率(66.7%),但检测的69个组织样品中,荧光定量PCR方法的检出率(50.7%)明显高于常规PCR方法的检出率(34.8%)。

鸡白痢沙门菌减毒候选疫苗株的环境应激评价及主要生物学特性测定

为评估鸡白痢沙门菌减毒候选疫苗株对环境应激及消毒剂的抵抗力,本研究对S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA、S6702△rfaG△csgA△ompR和S6702△rfaL△csgA△ompR等4种鸡白痢沙门菌双基因缺失株和三基因缺失株进行了生长曲线、生物被膜形成能力、药敏试验、环境应激试验及消毒剂的灭活效果的测定。结果显示,4株缺失株均丧失生物被膜形成能力并保留了与亲本株相似的药物敏感性。多基因缺失株对pH为4.0和8.0的培养条件较野生菌株和单基因缺失株更为敏感,呈现微耐酸和不耐碱的特性;所有菌株对54℃热处理和紫外线处理均敏感。消毒剂对实验菌株的杀灭效果显示,野生菌株和各基因缺失株均对0.01%的聚维酮碘溶液敏感,基因缺失株相比野生菌株过硫酸氢钾复合物更为敏感。因此,鸡白痢沙门菌减毒候选疫苗株对环境应激的抵抗力均有所降低,本研究为该菌后续候选疫苗株的进一步筛选奠定了基础。

重组型番鸭细小病毒JH10株的分子特征解析

为了解析番鸭细小病毒(MDPV)分离株JH10的分子特征,本研究对该毒株全基因组进行了扩增、测序、重组分析及遗传进化树的构建。结果显示:JH10株基因组由5071个核苷酸组成,P9启动子区和VP3基因内部约1.1 kb区域经历了重组,GPV鹅胚化弱毒株SYG61v参与了P9启动子区的重组,而GPV强毒株LH、B和SYG61v不同程度地参与了VP3基因内部的重组;以VP3基因重组片段构建遗传进化树,JH10株与8个经典型GPV株处于同一个进化分支中,而以毗邻的上下游非重组区片段分别构建的遗传进化树中,JH10株则与4个经典型MDPV株处于同一分支。本研究结果表明,JH10株为经典型MDPV和GPV之间的重组产物,该研究结果为进一步阐明重组型MDPV的致病机理奠定了基础。

一例猫特发性乳糜胸的诊治

1只2岁雄性布偶猫因呼吸急促、食欲下降而就诊。胸部X射线检查提示胸腔积液、右侧肺塌陷;胸腔穿刺抽取的穿刺液呈粉白色,穿刺液中三酰甘油含量远高于血液。经临床检查与实验室检查确诊为特发性乳糜胸伴发肺塌陷。患猫稳定体况后立即手术,进行胸导管结扎配合部分心包切除,并安置胸腔引流管。术后密切监测体况和胸腔积液、积气情况,第12天移除引流管,第18天出院,第8个月回访,患猫状态良好。说明手术是治疗特发性乳糜胸的有效手段。

兔可食性组织中杆菌肽残留量HPLC-MS/MS测定方法

建立兔可食性组织中杆菌肽残留标志物的HPLC-MS/MS检测方法。兔可食性组织(肌肉、脂肪、肝脏和肾脏)中杆菌肽残留用0.5%三氟乙酸水提取,10%三氯乙酸乙腈沉淀蛋白,正己烷除脂,HLB 150 mg固相萃取柱净化,以0.1%甲酸水和乙腈(0~0.5 min 15%乙腈,7.5~8.0 min 85%乙腈,8.1~10.0 min 15%乙腈)为流动相进行梯度洗脱。采用电喷雾离子源(ESI),正离子扫描,多反应检测(MRM)模式测定杆菌肽含量。杆菌肽在50~1000 ng/g的添加浓度范围内,浓度与响应值之间线性关系良好,相关系数大于0.99,本方法的检测限为30 ng/g,定量限为50 ng/g。杆菌肽平均添加回收率在74.7%~83.8%,批内批间变异系数均小于10%。实验建立的兔可食性组织中杆菌肽残留量的HPLC-MS/MS检测方法可满足兔可食性组织中杆菌肽残留量的检测要求。