一例禽呼肠孤病毒和滑液囊支原体混合感染的实验室诊断

2013年3月,江苏省宝应县某蛋鸡场饲养的一批5 000羽海蓝褐商品代蛋鸡从170日龄开始部分鸡陆续发生关节炎,部分病鸡肝脏还可见白色坏死点,累计发病率超过30%。无菌采集发病鸡肝脏和关节腔积液,分别用麦康凯琼脂平板和血平板进行细菌分离,结果均为阴性。根据禽呼肠孤病毒(ARV)σB基因和滑液囊支原体(MS)vlhA基因分别设计引物用于两种病原体的PCR检测,结果显示,以病鸡肝脏组织和关节腔积液提取的RNA样品为模板,通过RT-PCR均可扩增出约900 bp大小的ARV特异性条带,以关节腔积液提取的DNA样品为模板,通过PCR亦可扩增出200 bp大小的MS特异性条带,结合流行病学特征,可以将该鸡场暴发的疾病确诊为禽呼肠孤病毒和滑液囊支原体混合感染。

华东地区蛋鸡群中禽白血病的分子流行病学调查

为了解华东地区蛋鸡群中禽白血病的流行情况,2011年3月至2012年10月,从江苏、山东、安徽、上海等省市的蛋鸡养殖场中采集疑似禽白血病病例样品105份,经DF-1细胞分离培养、间接免疫荧光试验鉴定,从中分离禽白血病病毒（ALV）15株,继而对分离毒株gp85基因进行了序列测定和遗传进化分析。结果表明,在所获得的ALV分离株中,有A亚群ALV（ALV-A）3株,B亚群ALV（ALV-B）4株,剩余8株则均为J亚群ALV（ALV-J）。ALV-A、ALVB分离株遗传进化较为稳定,与其原型株（RAV-1、RAV-2）gp85基因核苷酸序列同源性均在98%以上,与我国近年来的地方分离株亲缘关系较远。ALV-J分离株与其原型株（HPRS-103）gp85基因核苷酸序列的同源性在92.8%~94.5%之间。8株ALV-J分离株中,只有1株与蛋鸡ALV-J分离株有较高的亲缘关系,其余均较远,反而与早期的肉鸡分离株有较高的亲缘关系,表明目前于华东地区蛋鸡群中流行的ALV-J可能来源于早期肉鸡分离株的感染。4株ALV-J分离株与我国地方品系HR土鸡的ALV-J分离株HR332J具有很高的亲缘关系,表明ALV-J的感染范围进一步扩大,对地方品系鸡也造成了很大的危害。

嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)灭活苗对商品猪免疫保护效力的研究

运用多功能细胞电穿孔仪将本实验室构建的重组pSK-dPCVl-2质粒转染Dulac细胞，传代培养后获得具有稳定感染细胞的重组嵌合型猪圆环病毒PCV1-2。将该重组病毒灭活后与ISA206VG佐剂乳化制成灭活苗，通过免疫效力试验来评价该疫苗的免疫保护效力。将42日龄PCV2母源抗体水平较低的20头商品猪随机分成4组，另外2头作为健康对照组。分2次免疫，通过检测不同时间的间接免疫荧光抗体滴度、中和抗体滴度、平均日增重、攻毒后病毒血症以及解剖后病理变化和组织中的病毒载量等各项指标评价疫苗的免疫保护效果。结果显示：二免后14d，所有免疫组试验猪都表现为PCV2血清学阳性，且中和抗体水平在1／15～1／20。在猪的增重方面，免疫组猪和健康对照组猪的体重都有增加，而攻毒对照组猪的体重没有增加，且3个免疫组和攻毒对照组之间平均日增重差异显著（P〈0．05）。攻毒后21d扑杀试验猪，免疫组猪的淋巴结和各脏器的大体和显微病变都比攻毒对照组轻微。攻毒对照组的淋巴结出现多核巨细胞和嗜酸性粒细胞，且有多量的淋巴细胞缺失，免疫组未见多核巨细胞，淋巴细胞缺失也较少。淋巴结中PCV2病毒载量的log10在攻毒对照组为5．566±0．432，在10^（4.0）、10^（5.0）、10^（6.0）。TCID50·mL^（-1）免疫组分别为4．469±1.023、4．434±0．716、3．521±0．958，其中10^（5.0）、10^（6.0）TCID50·mL^（-1）免疫组与攻毒对照组差异显著（P〈O．05），但是，试验期间各试验组和健康对照组均未观察到明显的类似PMWS的临床症状。断奶仔猪免疫10^（5.0）TCID52·mL^（-1）以上嵌合型猪圆环病毒PCV1-2灭活苗可以有效地抵抗PCV2b／1B／Jiangsu／JingJiang／2012／11／08病毒感染。

头孢喹肟与马立克病疫苗联用的试验观察

为了解头孢喹肟对马立克病疫苗的影响,以及头孢喹肟对鸡白痢的预防效果。将不同浓度的头孢喹肟与马立克病疫苗混合后置于25℃,不同时间点取样,采用病毒蚀班计数法进行疫苗效价测定。设头孢喹肟高、中、低3个剂量组,1日龄雏鸡注射混合液2 h后,人工诱发鸡白痢,记录10 d内每组的发病和死亡情况。在与马立克疫苗联合使用时,头孢喹肟的终浓度不超过0.5 mg/m L,混合液在室温放置时间不超过45 min,对疫苗效价无显著影响;头孢喹肟预防鸡白痢试验中,高剂量组和中剂量组的发病率和死亡率均不同程度低于低剂量组,且差异极显著(P<0.01);高剂量组与中剂量组之间发病率和死亡率不存在统计学差异。这证明头孢喹肟与马立克病疫苗联合使用是可行的。

猪圆环病毒重组Cap蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达PCV2-ORF2基因,并以构建的重组杆状病毒为免疫原,通过杂交瘤技术,研制针对PCV2的单克隆抗体,为建立准确快速的PCV2诊断方法奠定基础。首先将PCV2-ORF2基因克隆到杆状病毒的转移载体pFastBacTM1中,然后将其转化入大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中,与DH10Bac中的穿梭载体Bacmid发生转座,通过抗性和蓝白斑筛选,得到重组杆状病毒质粒reBacmid-ORF2,通过脂质体介导reBacmid-ORF2转染Sf9细胞,成功获得了表达PCV2-ORF2基因的P1代重组杆状病毒。将所获得的重组杆状病毒经Vivaflow200浓缩后,免疫6~8周龄BALB/c小鼠,取其脾脏与Sp2/0细胞融合,以IFA进行筛选,经多次亚克隆后得到3株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5H6、4E2和5F7。通过IFA、IPMA及Western-blot试验对3株单抗特异性进行分析鉴定。结果显示,3株单抗均能与PCV2-Cap蛋白产生特异性的反应,并利用流式细胞术初步建立了对PCV2毒株感染PK15细胞的检测方法,从而为快速检测PCV2病毒奠定了基础。